百菌清是一种广谱高效的农业杀菌剂，与真菌细胞中的三磷酸甘油醛脱氢酶发生作用，与酶中含有半胱氨酸的蛋白质结合，从而破坏酶的活性，使真菌细胞的新陈代谢受到破坏而失去生命力[1]。百菌清对子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲等真菌杀菌性能好。百菌清在农业上大量用作水果保鲜剂、杀虫剂，在工业上用作皮革、涂料、纸张、布料的防霉剂[2,3]。但是，百菌清是强致敏物，能引起迟发型变态反应性皮炎[4]，2017年10月27日世界卫生组织国际癌症研究机构将百菌清列入2B类致癌物清单，2019年4月29日欧盟委员会发布公告，宣布全面禁用百菌清[5]。皮革、食品、环境样品、涂料等样品中百菌清含量可用液相色谱、气相色谱、气质联用法、液质联用法等方法测定[6,7,8,9,10,11,12,13,14]，但尚未见文献报道对纺织品中百菌清残留量进行测定。本文采用超声萃取技术提取纺织品中残留的百菌清，采用气相色谱/质谱-选择离子监测法(以下简称GC/MS⁃SIM)对提取液进行测定，建立了测定纺织品中百菌清残留量的气质联用分析方法。1 试验部分1.1　仪器与试剂3510型Bransonic清洗器(美国Bransonic公司)；Agilent 6890A⁃7000B型三重四极杆气质联用仪(美国Agilent公司)。百菌清标准品(纯度99.0%)由美国Aldrich公司提供，色谱纯甲醇由美国Teida公司提供。用甲醇配制成质量浓度为428 μg/mL的标准储备液，再用甲醇逐级稀释，配制质量浓度分别为42.8 μg/mL、21.4 μg/mL、10.7 μg/mL、5.4 μg/mL、2.1 μg/mL、1.1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL的系列标准工作液。分析纯试剂均由广州江宏贸易有限公司提供。自制阳性样品：纺织纤维中使用最广、最有代表性的是棉、涤纶、羊毛和锦纶4种纤维。进行抗菌防霉整理的纺织品主要是内衣、床上用品和户外速干抗菌衣服三大类；内衣主要是棉、锦纶；床上用品主要是棉、涤；户外速干抗菌衣服主要是涤、锦纶。细菌最易滋生的纺织材料是蛋白质纤维。因此，分别以不含百菌清的涤纶衬布、棉衬布、羊毛衬布、锦纶衬布为基材，采用浸渍-焙烘法制备了4个含百菌清的阳性样品。1.2　样品前处理将样品用QYB-3型自动制样机裁成5 mm×5 mm的小块，混匀，称取1.0 g样品，置于装有30 mL乙酸乙酯的35 mL玻璃反应瓶中，45 ℃下超声萃取35 min。萃取液过滤至鸡心瓶后，在Heidolph 4003型旋转蒸发仪中真空蒸发至近干，转移至N⁃Evap112型氮吹仪中，用干燥氮气缓慢吹干后，用1 mL甲醇溶解残留物，所得溶液用0.45 μm滤膜过滤，供GC/MS⁃SIM分析用。1.3　分析条件色谱分离在DB⁃5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)上进行，初始温度为90 ℃，保持1 min后以40 ℃/min速度升至290 ℃，保持2 min；进样量为1.0 μL，进样方式为不分流进样，载气为高纯氦气(纯度99.999%)，载气流速为1 mL/min；进样口温度为270 ℃，传输线温度为280 ℃。离子源温度为290 ℃，电离方式为EI，电离能为70 eV；全扫描方式定性，选择离子监测模式定量，定量离子为m/z 266，定性离子为m/z 264、m/z 268、m/z 109。2 结果与讨论2.1　分析条件优化不分流进样时，质谱信号强度受进样口温度(因素A)、离子源温度(因素B)和载气流速(因素C)影响。首先单独考察这3个因素对质谱信号强度的影响，结果发现当进样口温度为260 ℃、离子源温度为280 ℃、载气流速为1.2 mL时，百菌清质谱峰面积均达到最大值。因此，按表1进行正交试验，测定峰面积，根据峰面积计算各因素的k值和极差，给出最优方案。从表1数据可知，因素A的极差最大，因素B的极差最小。因此对峰面积影响最大的因素是进样口温度(因素A)，其次是载气流速(因素C)和离子源温度(因素B)。通过正交试验，确定最优方案为A3B3C2，即方案9条件。在此条件下对标准溶液进行分析，得到的GC/MS⁃SIM图见图1。在tR为5.659 min处出现一个对应于百菌清的尖锐谱峰。XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.T001表1分析条件正交试验方案因素A/℃因素B/℃因素C/mL峰面积12602801.21 417 08422602701.01 539 82632602901.11 347 60642502801.0921 20452502701.1878 66462502901.21 069 37472702801.11 425 08782702701.21 584 47892702901.01 670 361k11 434 8391 254 4581 356 979k2956 4141 334 3231 377 130k31 559 9751 362 4471 217 119极差603 561107 989160 011XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.F001图1百菌清标准品的GC/MS⁃SIM图2.2　超声萃取条件的优化超声萃取效率取决于萃取溶剂种类、萃取温度(因素A)、萃取时间(因素B)和萃取溶剂体积(因素C)。首先以丙酮为萃取溶剂，对4个自制阳性样品进行超声萃取，单独考察这3个因素对萃取量的影响。结果发现，样品1、样品2在萃取时间为30 min时萃取量达到最大值，样品3、样品4在萃取时间为35 min时萃取量达到最大值；样品2在萃取温度为35 ℃时萃取量达到最大值，样品1、样品3、样品4在萃取温度为40 ℃时萃取量达到最大值；样品1、样品2、样品3、样品4在萃取溶剂体积分别为20 mL、30 mL、20 mL、25 mL时萃取量达到最大值。为考察这3个因素对萃取量的综合影响，按表2设计了正交试验。在每个条件下对4个自制阳性样品进行测试，萃取量列于表2中,分析计算每个因素的k值和极差，确定最优方案具体见表3。结果表明，样品1、样品2、样品3、样品4的最优方案分别为A3B3C3、A3B2C3、A3B3C3、A2B1C1。根据总萃取量计算，则最优方案为A3B3C3。综合考虑，最终确定的最优方案为A3B3C3，即萃取温度、萃取时间、萃取溶剂体积分别为45 ℃、35 min、30 mL。在此条件下，分别以丙酮、甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、叔丁基甲醚、正己烷/丙酮(1∶1,V/V)、乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1,V/V)等12种常见溶剂为萃取溶剂，对4个自制阳性样品进行超声萃取，萃取结果见表4。XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.T002表2超声萃取正交试验方案因素A/℃因素B/min因素C/mL样品1萃取量/mg·kg-1样品2萃取量/mg·kg-1样品3萃取量/mg·kg-1样品4萃取量/mg·kg-1总萃取量/mg·kg-114030251 4201 4621 7649255 57124025201 5721 4751 9949285 96934035302 1591 5761 9528856 57243530201 1781 4922 0079845 66153525302 2931 8112 1138867 10363535252 0581 0862 3771 0036 52474530302 0121 5992 2999686 87884525251 7621 5242 0121 0466 34494535202 0751 6512 2809916 997XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.T003表3超声萃取正交试验数据分析 单位:mg/kg样品1样品2样品3样品4总萃取量ABCABCABCABCABCk11 7171 5371 7471 5041 5181 3571 9032 0232 0519139599916 0376 0376 146k21 8431 8761 6081 4631 6031 5392 1662 0402 0949589539686 4296 4726 209k31 9502 0972 1551 5911 4381 6622 1972 2032 1211 0029609136 7406 6986 851极差2335605471281653052941807089778703661705XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.T004表4不同溶剂的萃取效果 单位:mg/kg溶剂样品1萃取量样品2萃取量样品3萃取量样品4萃取量总萃取量酸乙酯2 430.91 829.42 826.31 090.48 177.0丙酮2 094.81 861.42 278.61 074.27 309.1正己烷1 755.71 773.02 168.71 098.76 796.2甲醇1 619.02 191.52 373.31 088.77 272.4乙醇2 011.81 959.22 763.01 104.77 838.6乙腈2 322.21 921.12 670.31 099.98 013.4二氯甲烷2 294.32 268.82 434.5981.07 978.6石油醚2 034.51 855.01 922.5978.46 790.4叔丁基甲醚1 221.41 703.81 944.9780.45 650.4乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1,V/V)2 088.41 982.32 451.91 070.37 592.8正己烷/丙酮(1∶1,V/V)1 693.71 771.01 949.8823.36 237.8样品1、样品3的最佳萃取溶剂均为乙酸乙酯，样品2、样品4的最佳萃取溶剂分别为二氯甲烷和乙醇。为保证最终选定的溶剂对所有样品均有较好的萃取效率，利用总萃取量来作为判断依据。结果表明，当使用乙酸乙酯为萃取溶剂时，总萃取量最大。因此，萃取条件最终优化为以30 mL乙酸乙酯为萃取溶剂，在45 ℃下超声萃取30 min。2.3　方法的线性范围和检出限在上述分析条件下对系列标准工作液进行测试，用峰面积(a)对质量浓度(ρ)作图，结果发现，当百菌清质量浓度(ρ)为0.2 μg/mL~42.8 μg/mL时，峰面积(a)与质量浓度(ρ)线性相关，线性方程为a=95 399ρ-5 085，线性相关系数r=0.999 9。按信噪比(S/N)=3计算方法的检出限，检出限为0.1 mg/kg。2.4　方法的回收率和精密度以不含百菌清的棉衬布、涤纶衬布、锦纶衬布、羊毛衬布为空白基质，分别添加3个不同浓度水平的标准溶液，制成测试样，每个浓度水平各制备9个测试样。在上述条件下对各测试样进行分析，测定百菌清的回收率，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表5。平均回收率为81.9%~95.4%，相对标准偏差为1.8%~5.2%。XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.T005表5方法的回收率和精密度样品加入值/μg·mL-1平均回收率/%RSD/%棉1.183.24.5涤纶1.181.94.9羊毛1.182.35.2锦纶1.182.64.7棉5.489.63.2涤纶5.487.94.1羊毛5.488.53.6锦纶5.491.32.9棉21.495.41.8涤纶21.494.72.8羊毛21.491.52.4锦纶21.493.62.22.5　实际样品测试应用建立的方法对157个市售纺织品(其中面料样品73个，内衣样品46个，床上用品样品17个，其他服饰样品21个)进行测试，结果在一个条纹针织女式棉长裤中检出了百菌清，其含量为456.3 mg/kg。图2为该样品的GC/MS⁃SIM，图2中在5.655 min处出现对应于百菌清的一个尖锐谱峰。XX.XXXX/j.issn.1000-7415.2020.05.006.F002图21个阳性样品的GC/MS⁃SIM图3 结论以乙酸乙酯为萃取溶剂超声萃取纺织品中残留的百菌清，萃取液利用气相色谱/质谱⁃选择离子监测法进行外标法定量，从而建立了纺织品中百菌清残留量的气质联用分析方法，该方法简便快速，灵敏度高，检出限低至0.1 mg/kg，完全满足欧盟法规(EU)2019/677的限量要求，可适用于纺织品中百菌清残留量的日常检验工作。