为了进一步规范药品生产质量管理，我国于2010年修订了《药品生产质量管理规范》（GMP），对药品生产中洁净室的控制提出了更高要求。在GMP附录1中明确规定，生产企业应当对微生物数进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。《中华人民共和国药典》2015年版的颁布实施，为药品洁净实验室微生物监测和控制提供了指导原则，建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，有助于预期常见菌群，有助于评估清洁或消毒规程、方法、清洁或消毒剂及微生物监测方法的有效性，并有助于污染源的调查。定期开展药品企业的生产车间洁净室日常状态下的沉降菌检测，鉴定污染菌并分析其来源，便于掌握洁净车间使用管理的真实状态，为药品生产提供环境保障，为药品生产企业完善微生物监控体系提供依据。1　实验方法1.1　环境沉降菌的采集本单位及7个区域所完成了对区内包括NN市、LZ市、CZ市、GL市、WZ市、QZ市、BH市、YL市、GG市、BS市、HC市等37 家已通过《药品生产质量管理规范》（2010年版修订）的药品生产企业，共417间洁净室（区）环境进行检测。涉及90个生产车间，覆盖注射剂（包括小容量注射剂、大输液、滴眼液）、口服固体制剂（包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、茶剂等）、口液体服制剂（包括糖浆剂、口服溶液剂、酒剂等）、外用制剂（包括酊剂、洗剂、搽剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂等）、原料、中药前处理和提取车间等类型。根据《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》（GB/T 16294-2010）以及《药品生产质量管理规范》及其附录（2010年版修订）的有关规定，对药品企业生产车间关键监控点采集沉降菌，收集到的微生物经2次以上胰酪胨大豆琼脂平板（TSA，来源于北京三药科技开发公司，批号1309162）分离纯化，在36.0℃培养24ｈ后备用。1.2　环境微生物的鉴定采用MALDI-TOF-MS[1]和16Sr RNA基因测序方法[2]，将收集的微生物菌株进行鉴定和分析。2　实验结果2.1　检测统计根据产品生产类型，将生产车间洁净区划分为固体制剂车间、口服液体车间、外用制剂车间、提取车间、无菌制剂车间、原料药车间。其中，固体制剂车间洁净室（53.2%）、口服液体车间洁净室（17.0%）、外用制剂车间洁净室（17.0%），所占比例较大。见图1。10.16155/j.0254-1793...01.F001图1各生产车间洁净室及检出菌数量分布图Fig. 1The quantity distribution of clean room and detection bacteria in each production workshopa.洁净室（区）数量（number of clean rooms (areas)） b.检出菌数量（number of bacteria detected）2.2　沉降菌分析2.2.1　总体分析在417间洁净区检测中，277间采集到沉降菌（包括细菌和真菌），分离鉴定细菌和酵母菌共计1396株，分别归属于89个属，271个种。检出的沉降菌中，主要以革兰阳性菌为主，检出较多的菌属分别为不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短状杆菌属（Brachybacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、莫拉氏菌属（Moraxella）、库克氏菌属（Kocuria）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）等，其中占比较大的为葡萄球菌属（30.95%）、芽孢杆菌属（11.25%）、微球菌属（10.96%）、库克氏菌属（6.88%），见图2；检出较多的菌种分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、沼泽库克菌（Kocuria palustris）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、奥斯陆莫拉菌（Moraxella_sg_Moraxella osloensis）、污沟罗氏菌（Rothia amarae）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），其中占比较大的为藤黄微球菌（10.53%）、孔氏葡萄球菌（7.45%）、溶血葡萄球菌（5.37%）、沃氏葡萄球菌（4.37%）、表皮葡萄球菌（4.37%），见图3。在采集到沉降菌的277间洁净室中，125间有霉菌污染。10.16155/j.0254-1793...01.F002图2各车间沉降菌中检出的菌属分布Fig. 2Distribution of genera of bacteria detected in each workshop10.16155/j.0254-1793...01.F003图3各车间沉降菌中检出的菌种分布Fig. 3Distribution of species of bacteria detected in each workshop2.2.2　无菌制剂车间沉降菌分析在无菌制剂车间的洁净区采集到的沉降菌中，分离鉴定细菌5株，分别归属于1个属，3个种，即葡萄球菌属中的人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、孔氏葡萄球菌，见图4。10.16155/j.0254-1793...01.F004图4无菌制剂车间中检出的沉降菌Fig. 4Bacteria detected in sterile preparation workshop2.2.3　沉降菌不合格洁净室情况分析3家药品生产企业的4间洁净区沉降菌项目不合格，共同检出的菌属有芽孢杆菌属、库克氏菌属、葡萄球菌属，其中以葡萄球菌属污染为主，见表1。10.16155/j.0254-1793...01.T001表1沉降菌不合格洁净区检出情况Tab. 1Detection of sedimentary bacteria in unqualified clean area生产企业（manufacturer）洁净区/等级（clean area/ cleanliness level）沉降菌X¯（cfu·皿-1）（sedimentary bacteriaX¯）(cfu·dish-1)检出菌（detection bacteria）GXHB胶囊填充间（capsule filling room）/D300蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、玫瑰色库克菌（Kocuria roseus）、罗西法尔芽孢杆菌（Bacillus luciferensis）、沼泽库克菌（Kocuria palustris）、融酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）沸腾制粒间（boiling granulation room）/D125蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）、人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、海迪茨氏菌（Dietzia maris）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、海生库克菌（Kocuria marina）、斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、婴儿芽孢杆菌（Bacillus infantis）、海泥短小杆菌（Curtobacterium oceanosedimentum）、融酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXNZ压片室（tablets compression room）/D185藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、乳酪短杆菌（Brevibacterium casei）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、粘金黄杆菌（Chryseobacterium gleum）、斯氏皮肤球菌（Kytococcus schroeteri）、阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）、融酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）、沼泽库克菌（Kocuria palustris）NNDZ中药灭菌后室（Chinese herbal sterilization posterior room）/D136气生微杆菌（Microbacterium aerolatum）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、人纤维单胞菌（Cellulomonas hominis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、微黄库克菌（Kocuria subflava），霉菌（Mould）2.2.4　病原微生物分析根据《人间传染的病原微生物名录》（2006年）的细菌分类名录，分析各药品生产企业洁净区沉降菌检测中采集到的致病菌情况。经分离鉴定，检出有包括不动杆菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、普罗维登斯菌属（Providencia）、葡萄球菌属的14种病原微生物，主要涉及GXHBY、GXNZ、GXCZT、GXQZ、YLFT、QCRY、GXHB、NNDZ等28家药品生产企业。检出率较高的为蜡样芽孢杆菌和表皮葡萄球菌，在灌装（或灌封）间、制粒间、分装间、混合间、填充间、包装间和压片间等均有检出，见表2。10.16155/j.0254-1793...01.T002表2各药品生产企业洁净区检出的致病菌Tab. 2Pathogenic bacteria detected in clean areas of pharmaceutical manufacturers致病菌（pathogenic bacteria）药品生产企业（pharmaceutical manufacturer）生产车间/洁净区（production workshop/clean area）鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)GXHB、NNBH、NNHX①固体制剂车间（solid preparation workshop）/制粒间（granulation room）、混合制粒间（mixed granulation room），②原料药车间（API workshop）/包装间（packaging room）鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)GXHB、GXNZ、YLFT、GXYKD、PLYY、GXQZ①固体制剂车间（solid preparation workshop）/压片间（tablets compression room）、总混间（blending room）、包衣操作间（coating operation room）、制浆间（pulping room）、喷雾配液间（spray dispensing room），②口服液体车间（oral liquid workshop）/糖浆剂灌装间（syrup filling room）、配液间（dispensing room）、口服液灌封间（oral liquid filling and sealing room）蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GXNZ、YLFT、GXHB、YLZY、GXCZT、NNKN、GXCH、NNDZ、GXQZ、GXHTB、GXDL、GXTN①固体制剂车间（solid preparation workshop）/制粒间（granulation room）、包衣操作间（coating operation room）、沸腾制粒间（boiling granulation room）、颗粒分装间（particle separation room）、胶囊填充间（capsule filling room）、粉碎间（crushing room）、片剂分装间（tablet subpackage room）、制粒干燥间（granulation drying room）、压片间（tablets compression room）、铝塑包装间（aluminum plastic packaging room）、配浆间（coating mixture preparing room），②口服液体车间（oral liquid workshop）/气闸-拆外包（air brake- unpacking）、灌封间（filling and sealing room）、气闸-煮糖室（air brake- sugar boiling room），③外用制剂车间（external preparation workshop）/灌装间（filling room）、洁净走道（clean corridor），④提取车间（extraction workshop）/灭菌后室（post sterilization room）、中间站（intermediate station）极小棒杆菌(Corynebacterium minutissimum)GXJHT提取车间（extraction workshop）/粉碎间（crushing room）阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)GXHBY口服液体车间（oral liquid workshop）/分装间（subpackage room）、配液间（dispensing room）阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)GXHBY①固体制剂车间（solid preparation workshop）/制粒间（granulation room），②口服液体车间（oral liquid workshop）/分装间（subpackage room）霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)GXCZT固体制剂车间（solid preparation workshop）/颗粒分装间（particle separation room）路德维希肠杆菌 （Enterobacter ludwigii）GXHBY固体制剂车间（solid preparation workshop）/总混间（blending room）粉尘肠杆菌(Enterobacter pulveris)YLFT口服液体车间（oral liquid workshop）/糖浆剂灌装间（syrup filling room）、配液间（dispensing room）肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)GXHBY、GXNZ、GXCZT固体制剂车间（solid preparation workshop）/制粒间（granulation room）、高效包衣间（high efficiency coating room）奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)GXCZT、QCRY固体制剂车间（solid preparation workshop）/高效包衣间（high efficiency coating room）、颗粒混合制粒间（particle blending and granulation room）雷极普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)QCRY口服液体车间（oral liquid workshop）/配液间（dispensing room）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GXHB、GXCZT、NNDZ、GXBK①固体制剂车间（solid preparation workshop）/片剂分装间（tablet subpackage room）、颗粒分装间（particle separation room）、制粒干燥间（granulation drying room），②外用制剂车间（external preparation workshop）/灌装间（filling room）、称量备料间（weighing and preparation room）表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)GXBRT、GXBK、GXCH、GXCZT、DHYG、GXDL、GXHB、NNBH、NNDZ、NNHX、GXQZ、QCRY、GXSBT、GXSM、WZSJ、GXYKD、LYFT、LYZY、GLGXW、GLHNW、NNKN、PLYY、GXTN①固体制剂车间（solid preparation workshop）/铝塑包装间（aluminum plastic packaging room）、颗粒分装间（particle separation room）、制粒总混间（granulation final blending room）、压片间（tablets compression room）、胶囊填充间（capsule filling room）、高效包衣间（high efficiency coating room）、制粒干燥间（granulation drying room）、收粉间（powder collection room）、混合制粒间（mixed granulation room）、糖衣包衣间（sugar coating room）、配料间（weighing room）、煮浆间（siruping room）、袋分间（bagging room）、颗粒暂存间（particle temporary storage room）、内包间（immediate package room）、称量间（weighing room）、炼蜜间（honey refining room）、片剂制粒间（tablet granulation room），②口服液体车间（oral liquid workshop）/配料间（weighing room）、储藏室（storeroom）、灌装间（filling room）、灌封间（filling and sealing room）、配液间（dispensing room），③外用制剂车间（external preparation workshop）/灌封间（filling and sealing room）、配液间（dispensing room）、灌装间（filling room）、灌轧间（filling and rolling room）、配制间（preparation room），④提取车间（extraction workshop）/收膏间（paste preparation room）、真空干燥间（vacuum drying room）、灭菌后室（post sterilization room）、中药粉碎间（Chinese herbal crushing room），⑤原料药车间（API workshop）/包装间（packaging room）、包材暂存间（packing material temporary storage room），⑥无菌制剂车间（sterile preparation workshop）/灌封室灌封A区（potting room potting area A）2.2.5　沉降菌的同源性分析取在此次洁净区沉降菌检测中采集鉴定的、不同来源的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus），用MEGA 6. 0 软件进行16S rRNA 基因序列聚类分析，构建微生物同源性分析图（见图5,6）。结果显示，同一生产企业不同洁净区间或同一地域不同生产企业间采集到的微生物具有较高的同源性，亲缘关系较近。10.16155/j.0254-1793...01.F005图5藤黄微球菌16S rRNA 基因序列同源性分析树状图Fig. 5Dendrogram of homology analysis of 16S rRNA gene sequence of Micrococcus luteus注(note)：①GXTN：YTYQZ-口服液体-气闸（煮糖室）；YLZY：YYGZ-固体制剂-中间站02-320，YHGP -固体制剂-片剂分装间(YTYQZ- oral liquid workshop- air brake (sugar boiling room); YLZY: YYGZ- solid preparation workshop- intermediate station 02-320, YHGP - solid preparation workshop- tablet subpackage room)；②GXNZ：QNGL-固体制剂-铝塑分装间，QNGZ-固体制剂-中间体存放间(QNGL- solid preparation workshop- aluminum plastic packaging room, QNGZ- solid preparation workshop- intermediate storage room)；③GXCZT：LCZJ-固体制剂-胶囊填充室，LCZK-固体制剂-颗粒分装室，LCZY-固体制剂-压片一室(LCZJ-solid preparation workshop- capsule filling room, LCZK- solid preparation workshop- particle separation room, LCZY- solid preparation workshop- tablets compression room 1)；④DHYG：NDPB-固体制剂-泡罩包装室，NDSG-提取车间-收膏室(NDPB- solid preparation workshop- blister packaging room, NDSG- extraction workshop- paste preparation room)；⑤GLGXW：GXGC-固体制剂-称量间，GXYC-口服液体-称量间(GXGC- solid preparation workshop- weighing room, GXYC- oral liquid workshop- weighing room)10.16155/j.0254-1793...01.F006图6溶血葡萄球菌16S rRNA 基因序列同源性分析树状图Fig. 6Dendrogram of homology analysis of 16S rRNA gene sequence of Staphylococcus haemolyticus注(note)：①GXHBY：QHYF-口服液体-分装间，QHGK-固体制剂-颗粒分装间；GXNZ：QNGN-固体制剂-压片间，QNGW-固体制剂-中间体存放间(QHYF- oral liquid workshop- subpackage room, QHGK- solid preparation workshop- particle separation room; GXNZ: QNGN- solid preparation workshop- tablets compression room, QNGW- solid preparation workshop- intermediate storage room)；②GXDL：YDNB-外用制剂-内包材暂存，YDQJ-外用制剂-气闸室(YDNB- external preparation workshop- internal packaging material storage room, YDQJ- external preparation workshop- airlock room)；③GXHTB：NHCL-口服液体-称量室，NHYZ-提取车间-药粉周转间；GXCH：NCGZ-提取车间-干燥间，NCSG-提取车间-收膏间；GXYKD：NYTC-固体制剂-填充间(NHCL- oral liquid workshop- weighing room, NHYZ- extraction workshop- powder turnover room; GXCH: NCGZ- extraction workshop- drying room, NCSG- extraction workshop- paste preparation room; GXYKD: NYTC- solid preparation workshop- filling room)3　讨论3.1　微生物污染源分析从整体来看，检出的沉降菌以葡萄球菌属、芽孢杆菌属、微球菌属和库克氏菌属等为主。孔氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌为污染较多的葡萄球菌属，而藤黄微球菌是污染较多的微球菌属，这些菌通常附殖于人的皮肤、口腔及上呼吸道黏膜。通过对不同洁净区检出较多的藤黄微球菌和溶血葡萄球菌进行16S rRNA 基因序列聚类分析发现，同一区域间的微生物存在交叉污染的可能。在洁净区中检出上述菌，尤其在无菌制剂车间中检出，说明从事药品生产人员缺乏无菌操作意识，带入人源性污染。芽孢杆菌属[3]是土壤和植物微生态优势种群之一，可产生内生孢子，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射所造成的伤害，维持自身能力不受影响，洁净区中检出该类菌主要是由于原料、辅料或包装材料等灭菌不彻底引入的污染。库克氏菌属为放线菌门的革兰氏阳性菌属，以沼泽库克菌和嗜根库克菌检出较多。有文献报道[4]这两种菌为香蒲根面的污染菌，香蒲通常作为编织品和造纸的原料，在洁净区中检出该类菌，很可能是由于原料、辅料等的外包装材料灭菌不彻底带入的污染。在部分药品生产企业洁净区中还检出包括不动杆菌属[5]、芽孢杆菌属[6]、棒状杆菌属[7]、肠杆菌属[8]、克雷伯氏菌属[9]、变形杆菌属[10]、普罗维登斯菌属[11]、葡萄球菌属[12]的14种条件致病菌，这些菌是《人间传染的病原微生物名录》（2006年）的细菌分类名录中收载的病原菌，均为条件致病菌，当机体抵抗力降低时易引起机体感染，也是引起医院内感染的重要机会致病菌。如不动杆菌属可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等，重症者可导致死亡。上述致病菌不仅给从业人员带来危害，而且还对生产药品带来一定的风险。因此，各药品生产企业应根据《药品生产质量管理规范》及其附录（2010年版修订）的要求进一步加大从业人员的培训力度，不断提高相关人员的无菌操作意识，严格按照无菌操作进行更衣、清洁和消毒工作，同时还需加强环境和外源物品表面灭菌消毒的管理和监控。3.2　微生物污染控制在部分生产关键区域，如灌装（或灌封）间、制粒间、分装间、混合间、填充间和压片间等均检出较多的污染菌，也是沉降菌不合格的主要区域。在每次生产前后应加强对上述区域的工作台面、设备、地面、地漏的清洁消毒，特别是2个区域连接部分的隔离效果和消毒保障。企业应严格控制人员更衣和清洁程序，重点关注人员手套、衣服和帽子等的表面微生物，规范进入核心操作区域工作人员的无菌操作步骤，增加消毒灭菌频率并有计划地更换消毒剂。针对无菌药品的从业人员，尤其是质量管理人员和直接从事生产操作的人员应加强无菌生产和风险管理的理念，为药品的安全生产提供必要保障。2.3　制药企业风险管理应逐步构建药品生产企业微生物污染信息库，了解跟踪企业微生物污染重点环节，进行风险控制。此次检测中部分企业洁净区存在较高的污染风险水平：①微生物污染严重，沉降菌项目不合格，多间洁净区检出条件致病菌；②防虫设施不完善，洁净区内有蚂蚁；③微生物污染较多，多间洁净区沉降菌接近限量值，并检出条件致病菌；④部分洁净区微生物污染较多，大颗粒悬浮粒子接近限量值，并检出条件致病菌。存在上述情况的企业应加强对生产车间洁净区的环境控制及管理，定期对微生物污染情况进行风险评估，加强人员管控，完善质量体系。（ 本文于2019年10月17日收到 ）