食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）是亚洲最普遍的恶性肿瘤类型之一［1］。 铁死亡是一种涉及氧化还原平衡、线粒体活性、氨基酸和糖脂代谢等多个方面的细胞死亡机制［2］，可调节机体内氧化还原状态和改变细胞膜上的脂质过氧化水平，但其驱动ESCC进展的具体机制仍有待阐明。溶质载体家族7成员11蛋白（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）作为胱氨酸／谷氨酸反转运体（Xc-系统）的功能组分［3］，可以调节癌症细胞氧化还原稳态等病理生理过程［4］。肿瘤细胞能量代谢和代谢重编程是细胞生长的基础，也是肿瘤微环境塑造的关键因素。研究［5］显示，SLC7A11作为一个潜在的肿瘤治疗靶点在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中有较高的表达水平。其中SLC7A11在非小细胞肺癌中的高度表达并伴随着肿瘤细胞对葡萄糖和谷氨酰胺需求的上升，提示SLC7A11或许与肿瘤代谢水平相关［6］。SLC7A11在ESCC中的研究较少，该研究旨在探讨SLC7A11在ESCC组织中的表达与临床预后之间的关系及其对ESCC细胞增殖迁移等细胞特性的影响，并进一步分析其对ESCC细胞代谢过程的调控作用。1材料与方法1.1临床资料本研究于新疆石河子大学第一附属医院在2020年9月至2021年9月期间收集了569例石蜡组织样本。其中ESCC组织310例，癌旁的正常组织259例。病例采集均获得患者同意，并签署知情同意书。后进行随访，截止日期为2021年9月。伦理批号：2018-023-01。1.2主要试剂和仪器NC siRNA、SLC7A11 siRNA（上海吉玛制药技术有限公司，引物序列见表1）；SLC7A11抗体、GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：26864-1-AP、10494-1-AP）；免疫组化羊抗鼠/兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：RGAU011）；Lipofectamine 2000转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：18324012）；结晶紫染色液（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：C0121）；青-链霉素溶液、CCK-8试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0110、MA0225）；乳酸、葡萄糖、丙二醛、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate，ATP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A019-2-1、F006-1-1、A003-1-2、A006-1-1、A095-1-1）。显微镜（日本尼康公司，型号：eclipse ci pol）；酶标仪（德国BMG LABTECH公司，型号：SPECTROstar Omega）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1SLC7A11 siRNA 引物序列Tab. 1Sequences of SLC7A11 siRNA primersPrimerSequence （5′-3′）si⁃NCF： UUCUCCGAACGUGUCACGUTTR： ACGUGACACGUUCGGAGAATTsi⁃SLC7A11F： CUGGAGUUAUGCAGCUAAUTTR： AUUAGCUGCAUAACUCCAGTT1.3细胞培养ESCC细胞株（Kyse150）购于中国科学院生化与细胞生物学研究所。使用含有10%胎牛血清、1%青-链霉素溶液的1640培养基进行细胞培养。1.4细胞转染以每孔 5×104个Kyse150细胞铺于6孔细胞培养板，待细胞贴壁长至70%左右，将SLC7A11 siRNA与Lipofectamine2000转染试剂分别加入100 μL的1640无血清培养基中，混匀静置10 min，将两者混匀20 min后滴加于细胞中。1.5免疫组织化学肿瘤样本用10%福尔马林固定，经过石蜡包埋后切成4 μm切片。65 °C烘烤切片2 h后使用二甲苯脱蜡，后使用梯度乙醇（100%、95%和70%）进行水化。切片在装有EDTA缓冲液的高压锅中高压15 min，冷却40 min至室温。常温下使用3%的H2O2孵育组织切片，以防止内源性过氧化物酶的生成。组织切片与SLC7A11抗体（1∶1 000）在4 °C下孵育过夜。一抗孵育完成后，使用PBS冲洗洗去抗体，后滴加通用型免疫组化二抗（1∶1 000）在37 °C下单独孵育40 min，再次冲洗后进行显色、复染和酸乙醇分化，最后用树胶封片，在显微镜下观察结果并对SLC7A11的免疫组化切片染色进行评分。SLC7A11蛋白阳性信号位于胞质，染色呈浅黄、棕黄或棕褐。双盲阅片评分基于阳性细胞比例与染色强度。比例评分（0~4分）：0%～5%=0分，5%～25%=1分，25%～50%=2分，50%～75%=3分，75%=4分。强度评分（0~3分）：无=0分，淡黄=1分，棕黄=2分，棕褐=3分。两者乘积4分为低表达，≥4分为高表达。1.6Western blot实验冰上刮取并裂解Kyse150细胞转染处理组和对照组的细胞，12 000 r/min离心20 min处理后得到蛋白液。BCA蛋白定量，加入5×Loading buffer，煮沸变性。经过制胶、上样、电泳、转膜、封闭步骤后，与SLC7A11、GAPDH抗体4 °C 孵育过夜。洗去一抗后常温孵育羊抗鼠/兔二抗 （1∶10 000） 2 h。清洗二抗之后，ECL发光液显影。1.7CCK-8 法检测各组细胞增殖活性使用靶向SLC7A11基因 siRNA，si-NC转染Kyse150细胞系，48 h后计数2 000个细胞接种到96孔板中，每组设置6个复孔。连续6 d于同一时间点使用CCK-8试剂盒对细胞活力进行测量，将10 µL CCK-8试剂加入每个孔中，37 ℃静置2 h后，使用酶标仪测量450 nm的吸光度值，并取平均值。通过计算各实验组与对照组之间的差异表达量并绘制成曲线。1.8平板克隆形成实验使用siRNA转染培养48 h后，将500 个活细胞接种在6孔板中，一式3份，并在完全培养基中培养10 d。使用4%多聚甲醛固定20 min，并用0.1%结晶紫染色20 min，晾干拍照并计数。1.9Transwell实验计数20万个细胞并使用400 μL无血清培养基重悬加入小室，将小室放于含600 μL 20%血清培养液的24孔板小孔中培养 24 h，吸去上室培养基并使用4%多聚甲醛将其固定，后加入结晶紫染色，洗净晾干后于显微镜下观察并计数迁移细胞数。1.10乳酸、葡萄糖、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH、ATP浓度检测收集转染后的细胞，按照乳酸，葡萄糖，MDA，还原型谷胱甘肽，ATP检测试剂盒的说明书进行操作，按照要求在酶标仪相应的波长进行检测，并进行分析。1.11统计学处理使用SPSS 22.0 软件进行数据统计，对表格数据进行个案加权，计数资料以n （%）表示，组间比较采用 χ2检验或Fisher确切概率检验；计量资料以x¯±s表示，正态分布且方差齐的组间两两比较使用Student’s t检验，多组间均值比较使用单因素方差分析（ANOVA），事后进行Tukey多重比较检验。采用Kaplan-Meier 法进行生存分析。GraphPad Prism 9.0用于绘制柱状图。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SLC7A11蛋白在ESCC及癌旁正常组织中的表达情况ESCC组织和癌旁正常组织免疫组化染色显示，SLC7A11蛋白主要富集在ESCC组织中的胞质（图1）。统计结果显示癌组织中SLC7A11的蛋白表达明显高于癌旁正常组织（χ2=270.88，P0.001）。见表2。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图 1免疫组织化学染色法检测不同组织中 SLC7A11 表达情况Fig.1Expressions of SLC7A11 in different tissues detected by immunohistochemistry stainingA-C： Expression of SLC7A11 in normal tissues adjacent to esophageal cancer； D-F： Expression of SLC7A11 in ESCC tissues.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T002表2SLC7A11在ESCC与癌旁正常组织中的表达情况 ［n （%）］Tab. 2Expressions of SLC7A11 in ESCC and normal adjacent tissues ［n （%）］GroupImmunohistochemical staining （IHC staining）χ2 valueP valueLow expressionHigh expressionNormal221 （85.3）38 （14.7）270.880.001ESCC50 （16.1）260 （83.9）2.2SLC7A11蛋白表达与临床病理特征之间的关系根据免疫组化评分将具有完整临床信息的172例ESCC患者分为SLC7A11低表达组（≤4分，43例）与 SLC7A11高表达组（4分，129 例）。表3中统计结果显示，肿瘤分化程度（χ2=8.198，P0.001）与SLC7A11表达水平呈正相关。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T003表3SLC7A11蛋白与ESCC患者临床病理资料的关系 ［n （%）］Tab. 3The relationship between SLC7A11 protein and clinical pathological data of ESCC patients ［n （%）］VariableExpression of SLC7A11 in ESCCnLow expressionHigh expressionχ2valueP valueGenderMale10529 （27.6）76 （72.4）0.9860.321Female6714 （20.9）53 （79.1）Age （years）≤608220 （24.4）62 （75.6）0.3100.860609023 （25.6）67 （74.4）Differentiation degreeHigh3114 （45.2）17 （54.8）8.1980.004Medium and low14129 （20.6）112 （79.4）T stageT1+T27621 （27.6）55 （72.4）0.5030.478T3+T49622 （22.9）74 （77.1）N stageN0+N111830 （25.4）88 （74.6）0.0360.850N2+N35413 （24.1）41 （75.9）TNM stageⅠ+Ⅱ10021 （21.0）79 （79.0）2.0390.153Ⅲ+Ⅳ7222 （30.6）50 （69.4）2.3SLC7A11蛋白表达与ESCC患者预后的关系对随访信息完整的患者进行统计分析并绘制生存曲线，生存分析的结果显示，ESCC患者中SLC7A11蛋白高表达的患者生存周期明显低于SLC7A11低表达的患者，且差异有统计学意义（图2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2SLC7A11蛋白的表达情况与ESCC患者预后生存曲线图Fig. 2Survival curves of ESCC patients stratified by SLC7A11 protein expression levels2.4细胞学实验验证SLC7A11表达对ESCC细胞的影响Western blot实验检测不同SLC7A11 基因siRNA浓度（50、75 nmol/L）和75 nmol/L Lipofectamine 2000作用下SLC7A11蛋白表达水平，结果显示与对照组相比，转染浓度在75 nmol/mL的沉默效果最佳，SLC7A11蛋白表达量最低（t=8.963， P0.001）（图3A）。使用最佳转染条件转染Kyse150细胞系并进行细胞学实验以验证SLC7A11的表达对ESCC增殖与迁移的影响。CCK-8实验结果显示，SLC7A11水平降低后ESCC细胞的增殖能力较阴性对照组降低，且在第5天（t=4.75， P0.01）以及第6天（t=13.17， P0.001）两者增殖能力具有统计学差异（图3B）。平板克隆实验同样显示SLC7A11表达降低之后细胞的集落形成能力降低（t=13.89， P0.001）（图3C）。Transwell 实验显示，SLC7A11水平的降低可以明显降低肿瘤细胞的迁移能力（t=33.08， P0.001）（图3D）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3SLC7A11对于ESCC细胞增殖迁移水平的影响Fig.3The effects of SLC7A11 on the proliferation and migration level of ESCC cellsA： Western blot was used to verify the transfection efficiency of SLC7A11； B： CCK-8 was used to assess the viability of ESCC cells； C： Plate colony formation was used to evaluate the proliferation ability of ESCC cells； D： Transwell was used to assess the migration ability of ESCC cells； ***P0.001 vs NC group； ##P0.01， ###P0.001 vs si-ctrl group.2.5ESCC患者肿瘤葡萄糖代谢与铁死亡的关系铁死亡本质是细胞氧化还原水平的破坏，MDA是脂质过氧化的终产物，一定程度上可以代表细胞铁死亡的水平。使用不同浓度梯度的铁死亡诱导剂（erastin）处理细胞后，细胞MDA随药物浓度升高（F趋势=416.0， P0.001），细胞的脂质过氧化水平升高，说明细胞铁死亡水平升高（图4A）。为验证葡萄糖水平与铁死亡的相关性，以不同浓度梯度的erastin同时处理无葡萄糖培养基和高葡萄糖（4 500 mg/L，约25 mmol/L）培养基中培养的Kyse150细胞，检测细胞活力的变化，结果显示，在无葡萄糖培养基中erastin处理后细胞活力差异无统计学意义（图4B），但在高葡萄糖培养基中细胞活力随着erastin浓度升高呈剂量依赖性降低（F趋势=180.70， P0.001）（图4C），提示ESCC中的铁死亡与ESCC的肿瘤葡萄糖代谢有关。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4不同浓度erastin处理下ESCC细胞丙二醛水平及不同浓度葡萄糖培养基中ESCC细胞活力Fig.4The effects of erastin on MDA levels and cell viability of ESCC cells under different erastin concentrations and different glucose concentrationsA： Changes in malondialdehyde （MDA） levels in ESCC treated with different concentrations of erastin； B， C： Changes in cell viability under different concentrations of erastin in glucose-free and high-glucose culture conditions； **P0.01， ***P0.001 vs 0 μmol/L group.2.6SLC7A11水平与ESCC的代谢相关性SLC7A11是Xc-系统（胱氨酸/谷氨酸反转运体）的核心成分，负责胱氨酸的摄取和谷氨酸的释放，驱动GSH的生物合成。该基因的表达异常可能重塑ESCC的代谢特征，结果显示SLC7A11基因敲低之后GSH水平下降（t=10.56， P0.001），图5A。通过使用试剂盒检测降低SLC7A11表达之后ESCC细胞、丙酮酸ATP、乳酸水平的变化，检测结果显示SLC7A11水平敲低后细胞丙酮酸（t=60.20， P0.001）、ATP（t=49.07， P0.001）、乳酸（t=17.35， P0.001）的水平均降低（图5B-5D）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5SLC7A11敲低后ESCC中GSH、丙酮酸、ATP、乳酸水平的变化情况Fig.5SLC7A11 knockdown altered GSH， pyruvate， ATP， and lactate levels in ESCCA-D： GSH， pyruvate， ATP and lactate levels in ESCC under different treatment groups were measured by GSH， pyruvate， ATP and lactate kits； ***P0.001 vs si-ctrl group.3讨论目前，ESCC严重威胁到人类健康［7］。铁死亡是一种新发现的细胞死亡机制，主要由细胞内脂质活性氧的生成和降解平衡失调引起［8］。针对铁死亡具体机制的研究对于深入了解ESCC的发生发展以及改善ESCC患者预后具有极其重要的意义。SLC7A11作为铁死亡的关键上游调节因子［9］，本研究利用免疫组化技术揭示了其在ESCC中的阳性表达率（83.9%）显著高于正常组织（14.7%）并定位于组织细胞胞质；结合临床病理分析，结果显示SLC7A11的表达与患者的肿瘤分化程度相关（P0.01）；预后分析显示SLC7A11高表达患者生存时间降低，由此认为SLC7A11可以作为诊断以及判断ESCC预后的一个分子。本研究中，通过瞬时转染靶向SLC7A11的小干扰RNA（siRNA），使食管鳞状细胞癌ESCC细胞系中SLC7A11的表达得以有效敲低；采用CCK-8、平板克隆、Transwell等实验，证明SLC7A11可以影响ESCC发生发展进程，其水平降低可以使肿瘤细胞增殖，集落形成能力以及迁移水平下降。近几十年来，越来越多的证据表明了代谢与恶性肿瘤增殖之间的关系。有课题组在早期研究中，利用非靶向代谢组学方法，提示ESCC患者的糖酵解水平与正常人存在差异［10］。 Warburg 效应，即有氧糖酵解，是指肿瘤在富含氧气的情况下也能增强葡萄糖向丙酮酸盐以及乳酸盐的转化，是癌症进展机制的核心因素［11］。随着这一效应的发现，人们认识到肿瘤细胞的新陈代谢在癌症进展中起着至关重要的作用。铁死亡诱导剂erastin通过抑制Xc-系统发挥作用，其在无糖以及高糖培养基中对ESCC铁死亡调控水平的差异提示ESCC细胞铁死亡与其代谢相关。SLC7A11作为Xc-系统重要组成部分或许也起到了重要的作用，其可以将细胞外胱氨酸转运到细胞内，用于半胱氨酸的产生和GSH的生物合成，与氨基酸代谢密切相关；在SLC7A11基因敲低后，ESCC细胞GSH水平降低，意味着ESCC细胞内的氧化还原稳态被破坏，证实了SLC7A11水平的下降促进了铁死亡进程。糖代谢重编程在癌症发展中起着重要作用，为进一步探究SLC7A11这一分子在ESCC进展中的作用机制，以及证明SLC7A11是否与ESCC的代谢微环境糖酵解相关，本研究采用试剂盒检测SLC7A11基因敲低的情况下，糖酵解相关产物ATP、乳酸、丙酮酸的变化，结果显示ATP、乳酸、丙酮酸的水平均降低，提示SLC7A11水平的降低在使ESCC铁死亡水平升高的同时诱导了糖酵解功能的障碍，可能为ESCC患者的治疗及预后的改善提供新的思路。尽管本研究揭示了SLC7A11在ESCC中的重要作用，但仍存在着缺乏动物模型验证、具体调控机制仍未明确等缺陷。下一步将通过动物实验和更多的细胞学实验寻找并验证SLC7A11在ESCC中表达的分子机制，进一步研究SLC7A11在ESCC中的影响和作用。