2025 - 录用;接受;:10 - 09 接收在肿瘤诊疗领域，受体介导的主动靶向药物递送系统由于其特异性的受体－配体相互作用，可提高药效并降低毒副作用，长期受到药学工作者的青睐［1–2］。转铁蛋白（transferrin， Tfn）是Tfn受体（Tfn receptor，TfR）的特异性配体，其作为靶向配体被广泛应用于肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、脑胶质瘤等恶性肿瘤的治疗［3–5］。基于Tfn修饰的纳米给药系统种类繁多，如聚合物胶束、固体脂质纳米粒、纳米囊和脂质体［6–7］等。Tfn通常通过成酰胺反应对纳米药物递送系统进行修饰［8］，随后的纯化方法按原理可分为两类［7， 9–12］：基于分子量截留的膜分离技术（如透析、超滤）和基于分子排阻的分离技术（如葡聚糖凝胶柱分离）。该文考察比较了超滤法和葡聚糖凝胶法在纯化效率、纯化所得胶束表面Tfn修饰密度方面的异同，以期为今后Tfn修饰的纳米药物递送系统的设计及其他配体修饰的纳米递送系统的构建提供参考。1材料与方法1.1主要仪器N-1300型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）、FDU-2110型冷冻干燥机（上海爱朗仪器有限公司）、Nano-ZS90型激光粒度仪（英国Malvern公司）、F4600型荧光分光光度计（日本Hitachi公司）、JEM-2100PLUS型透射电镜（日本JEOL公司）、Centrifuge5424型离心机（德国Eppendorf公司）、DNM-9602G型酶标分析仪 （北京普特新科技术有限公司）、Sorvall ST 16R型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。1.2主要试剂和耗材端羧基聚乙二醇聚己内酯嵌段共聚物（HOOC-PEG2000-b-PCL5000，批号：MKCM9500）购自德国Merck公司；香豆素-6（Coumarin-6，C6，批号：LT60P69）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS，批号：LA70P85）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（ethyl dimethyl aminopropyl carbodiimide，EDC，批号：LUA0P62）均购自北京百灵威科技有限公司； 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（morpholinoethanesulfonic acid solution，MES，批号：827C021）、葡聚糖凝胶G-150（批号：20230509）均购自北京索莱宝科技有限公司；乙腈（色谱纯，批号B2211267，纯度≥99.9%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人Tfn（批号：102436695）、SigmaPrepTM spin column离心柱套装（批号：1003249901）均购自美国Sigma-Aldrich公司；Micro BCATM Protein Assay Kit 23235（批号：XK358025）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Amicon®Ultra-4超滤离心管（型号：MWCO100K，批号：0000216249）购自美国Merck Millipore公司。1.3方法1.3.1Tfn/聚己内酯（Tfn/polycaprolactone，Tfn/PCL）胶束的制备与表征本文制备了两种Tfn修饰密度的PCL胶束（Tfn/PCL高、Tfn/PCL低）。首先通过薄膜水化法制备载有荧光探针C6的PCL胶束（PEG-PCL-C6）。于25 mL茄形瓶中加入PEG-PCL（1 mg/mL）和C6（0.5 μg/mL）的乙腈混合液4 mL，于60 ℃减压旋蒸至完全成膜后，加入60 ℃的PBS溶液2 mL，涡旋后超声分散5 min，12 000 r/min条件下离心5 min，除去游离C6沉淀，上清液即为PEG-PCL-C6胶束的PBS分散液。取该分散液1 mL，依次加入0.09 mg NHS、0.16 mg EDC以及1 mL MES，室温搅拌20 min后，加入Tfn的PBS溶液（10 mg/mL，nPCL∶nTfn=1∶2）4.5 mL，调节体系的pH值在8.5左右，室温避光搅拌8 h，即得Tfn高修饰密度的PCL胶束Tfn/PCL高。同样的方法制备Tfn低修饰密度的PCL胶束Tfn/PCL低（nPCL∶nTfn=100∶15）。最终通过荧光分光光度法，以PBS为稀释剂，调节两种胶束中C6浓度一致，备用。采用动态光散射法测定胶束的粒径大小及粒度分布情况。设定粒度测定仪的波长为633 nm，入射光与散射光束的夹角为90°，测定温度为25 ℃，每个样品的测定循环数为自动。两种胶束的外观形态通过透射电镜法（transmission electron microscope，TEM）进行观察。简言之，将胶束的水分散液置于铜网上，静置、负染、晾干后观察并拍照。1.3.2胶束中C6含量的测定本文采用荧光分光光度法进行C6含量的测定。精密称取适量C6，以甲醇为溶剂系统分别配制成1、5、10、20、50、100 ng/mL系列浓度的标准溶液。测定条件如下：激发/发射波长（λex/λem）为450 nm/505 nm，夹缝宽度为5 nm/5 nm。分别取0.5 mL上述标准溶液进行荧光强度测定，每个浓度平行测定3次。以C6浓度与荧光强度进行线性回归，绘制标准曲线。精密吸取PCL胶束悬浊液2 mL加入Amicon® Ultra-4超滤离心装置中，于7 000 r/min条件下离心10 min，弃去滤液，于超滤离心装置的浓缩液中再次加入去离子水3 mL重悬胶束，重复离心操作。小心洗涤并转移离心装置中的浓缩液于西林瓶中，冻干后称重，即得到载有C6的PCL胶束的质量。将冻干后的胶束溶于适量甲醇中，充分涡旋混匀使包载在胶束内部的C6完全释放并溶解。按照前述荧光分光光度法条件进行测定，对照标准曲线计算胶束中C6的浓度，按照如下公式计算载药量。载药量%=测定的胶束中C6含量胶束的总质量×100%取浓缩液或洗脱液以甲醇稀释适当倍数，充分涡旋混匀后，置于四透石英比色皿中，按1.3.1项下方法操作，进行C6荧光强度测定，记录Height值，带入标准曲线，计算C6浓度。1.3.3Tfn/PCL胶束的纯化为分离制备Tfn/PCL胶束过程中未完全反应的游离Tfn，需要对制备的胶束进行分离纯化处理。本文对两种经典的纯化方法进行比较：超滤法和葡聚糖凝胶法。1.3.3.1超滤法取待纯化的Tfn/PCL胶束1 mL，加至去离子水润洗后的Amicon® Ultra-4超滤离心装置中，离心条件如下：转速设置7 000 r/min，时长10 min，温度4 ℃，加速/减速系数为6。离心1次后，收集滤出液记为Ⅰ，小心转移出离心装置中的浓缩液，以PBS缓冲液洗涤离心装置3次，合并浓缩液与洗涤液至最终体积为1 mL，记为浓缩液a；取990 μL浓缩液I进行第2次超滤纯化，收集滤出液记为Ⅱ，同样的操作收集浓缩液记为b；以此类推重复该超滤纯化操作，共计离心纯化4次，得到浓缩液a、b、c、d，以及滤出液Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ。1.3.3.2葡聚糖凝胶法葡聚糖凝胶G-150提前于去离子水中溶胀24 h备用。取1 mL充分溶胀的葡聚糖凝胶悬浊液加入Sigma PrepTM离心柱中，于1 000 r/min转速下离心1 min，弃下清液。在形成的葡聚糖凝胶柱表面小心滴加40 μL待纯化的Tfn/PCL胶束分散液，于1 000 r/min转速下离心4 min，收集离心管底部滤出的胶束分散液。取该滤出液40 μL，重复上述离心操作，收集滤出的胶束分散液。共计离心纯化4次，得到滤出纯化的胶束分散液分别标记为1、2、3、4。1.3.4纯化效果分析Tfn/PCL胶束的制备原理是利用Tfn分子中的伯氨基与PEG-PCL上的羧基通过成酰胺反应进行偶联。纯化效果指的是除去未连接的游离Tfn分子的能力。本文比较了两种纯化分离方法。根据超滤管的分离原理，超滤法的纯化指标是滤出液中不再检出Tfn，且浓缩液中Tfn量与C6量的比值趋于恒定时，认为纯化完全；根据葡聚糖凝胶的分离原理，葡聚糖凝胶法的纯化指标是当滤出液中Tfn含量与C6量的比值恒定时，可认为胶束被纯化完全。Tfn含量的测定方法采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法。简言之，取纯化后的浓缩液以及滤液稀释适当倍数后，冰浴超声分散5 min，取样20 μL加入96孔板中，然后加入按照说明书配制的工作液200 μL/孔，每个样品设置3组平行对照，充分混匀后，于37 ℃ 避光孵育30 min，在540 nm处用酶标仪测定吸光度，按照标准曲线计算Tfn的含量。1.4统计学处理本文采用GraphPad Prism 10.0 软件进行数据的统计学分析。各数据结果以x¯±s表示，采用t检验和单因素方差分析（ANOVA），双尾P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1胶束的粒径及外观形态各胶束粒径及外观形态结果如图1所示。PEG-PCL-C6胶束（图1A、1D）、Tfn/PCL低胶束（图1B、1E）以及Tfn/PCL高胶束（图1C、1F）的粒径大小及多分散指数（polydisperse index，PDI）分别为（73.11±1.78）nm（PDI：0.231±0.057）、（134.51±1.03）nm（PDI：0.296±0.062）、（158.20±1.26）nm（PDI：0.211±0.006），Tfn修饰后胶束的水化粒径明显增大，且随着修饰密度的增加，粒径增大。由TEM结果可知，制得的胶束外观均为圆整的球形结构。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1PCL胶束粒径大小及外观形态TEM照片 ×10 000Fig.1Particle size and TEM images of the PCL micelles ×10 000A，D： PEG-PCL-C6； B，E： Tfn/PCLLow； C，F： Tfn/PCLHigh.2.2胶束的载药量2.2.1C6标准曲线各浓度C6溶液对应的荧光强度数据结果见表1。以C6溶液浓度C（ng/mL）为横坐标，对应的荧光强度Height值为纵坐标进行线性回归（图2），得线性方程H=0.369 1 C+0.512 7，R²=0.999 5，结果表明，C6在1~100 ng/mL浓度范围内，浓度与荧光强度线性关系良好。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1不同C6浓度对应的荧光强度值Tab. 1Fluorescence intensity of C6 solutionVariableC6 （ng/mL）15102050100Height1.1332.6974.1197.43218.72337.63110.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2C6标准曲线Fig.2Standard curve of C62.2.2PCL胶束载药量共考察了3批样品，获得冻干胶束质量及其中C6含量如表2所示。根据公式：胶束的载药量=测定的C6含量胶束的总质量×100%，可得3批样品胶束的载药量分别为0.046%、0.045%以及0.047%。由结果可知，在该工艺下，胶束的载药量波动不大，平均载药量为0.046%，制备工艺稳定，能够为后续纯化方法的评价提供科学依据。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T002表2三批冻干胶束质量及C6含量 （n=3）Tab. 2The batch quality and C6 content of three batches of lyophilized micelles （n=3）VariableBatch No.1Batch No.2Batch No.3Weight of micelles （mg）3.5233.1593.490Content of C6 （μg）1.6341.4361.6422.3纯化效果评价2.3.1超滤法将制得的胶束用超滤管连续纯化4次，对收集的滤出液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行Tfn含量检测，结果见表3。对浓缩液a、b、c、d进行Tfn含量测定和C6含量测定，并计算Tfn/C6的浓度比例，结果见表4。由结果可知，对于高密度修饰的Tfn/PCL高组，滤过2次后，滤出液中基本检测不出Tfn的存在，同时结合上清液中Tfn/C6比值的变化可知，纯化2次后，Tfn/C6比值基本保持不变，可知纯化完全。而对于低密度修饰的Tfn/PCL低组，滤过1次后，滤出液中几乎检测不出Tfn的存在，上清液中Tfn/C6的比值基本保持不变，可知离心1次后，即可纯化完全。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T003表3超滤法滤出液中Tfn含量 （mg/mL）Tab. 3Content of Tfn in the filtrate obtained by ultrafiltration method （mg/mL）FiltrateTfn/PCLHighTfn/PCLLowI3.9640.029Ⅱ0.013-Ⅲ--Ⅳ--10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T004表4超滤法浓缩液中Tfn含量、C6含量、Tfn/C6比值Tab. 4Content of Tfn， C6， and the Tfn/C6 ratio in the concentrate obtained by ultrafiltration methodDensity of TfnConcentrateabcdTfn/PCLHighTfn （mg/mL）27.25630.25530.82431.608C6 （μg/mL）1.1441.2821.3081.341Tfn/C623.82523.60023.56623.570***Tfn/PCLLowTfn （mg/mL）9.4078.2278.0057.696C6 （μg/mL）2.7442.4052.3392.256Tfn/C63.4283.4213.4223.411***P0.001 vs supernatant a.2.3.2葡聚糖凝胶法将同一批待纯化的Tfn修饰胶束，取40 μL按1.3.3.2项下操作，进行纯化。对收集的滤出液1、2、3、4进行Tfn和C6含量检测，并计算比值。结果见表5。由结果可知，对于高密度修饰的Tfn/PCL高组，滤过2次后，滤出液中Tfn/C6比值基本保持不变，可初步确定纯化完全，这与超滤法的现象一致。有趣的是，对于低密度修饰的Tfn/PCL低组，葡聚糖凝胶法与超滤法存在明显不同的现象：葡聚糖凝胶法中，4次滤液中的Tfn/C6的比值变化呈略上升趋势，滤过3次后，该比值才趋于基本稳定。Tfn/C6比值滤过1次（3.510）和滤过4次（3.571）存在显著性差异（t=2.917，P=0.043 4），这一现象引起注意，因此该研究拟通过计算胶束表面Tfn的修饰密度来进一步判断。根据胶束的载药量，以及测得的C6和Tfn的浓度，通过下述公式计算胶束表面Tfn的修饰密度。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T005表5葡聚糖凝胶法滤出液中Tfn、C6含量、Tfn/C6比值Tab. 5Content of Tfn， C6， and the Tfn/C6 ratio in the filtrate obtained by sephadex gel methodDensity of TfnFiltrate1234Tfn/PCLHighTfn （mg/mL）1 339.883541.452227.91794.885C6 （μg/mL）55.88222.8099.6044.002Tfn/C623.97723.73923.73123.709***Tfn/PCLLowTfn （mg/mL）201.13079.90833.27014.077C6 （μg/mL）57.30622.5679.3013.942Tfn/C63.5103.5413.5773.571**P0.05， ***P0.001 vs filtratet 1.Tfn%=CTfn/80 000(Cc60.000 46-Cc6)/7 000×1 000×100%结果如表6所示。由结果可知，两种纯化方法相比，无论高密度组还是低密度组胶束，葡聚糖凝胶法纯化所得胶束表面Tfn修饰密度均高于超滤法纯化所得纯化胶束，但仅在低密度组该差异较明显：滤过4次后，葡聚糖凝胶法纯化所得胶束表面Tfn密度为14.38，超滤法纯化所得胶束表面Tfn密度为13.74，差异有统计学意义（t=8.134，P=0.000 2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T006表6两种方法纯化的Tfn/PCL胶束表面Tfn的修饰密度（%）Tab. 6Surface modification density of Tfn on Tfn/PCL micelles purified by two methods （%）Densityof TfnMethoda/1b/2c/3d/4Tfn/PCLHighUltrafiltration95.9495.0394.9094.91Sephadex gel96.5595.5995.5695.47Tfn/PCLLowUltrafiltration13.8013.7813.7813.74Sephadex gel14.1314.2614.4014.38******P0.001 vs Tfn/PCLLow ultrafiltration method d/4.3讨论从上述结果可以看出，在当前实验条件下，超滤法和葡聚糖凝胶法的纯化效率相近：在Tfn过量情况下（nPCL∶nTfn =1∶2），两种方法均需要不少于2次的纯化操作即可将过量的Tfn分离完全；而在Tfn修饰密度较低的情况下（nPCL∶nTfn =100∶15），纯化1次即可。在纯化后获得Tfn修饰胶束的纯度方面，两种方法存在显著性差异：葡聚糖凝胶法纯化后获得的Tfn/PCL胶束表面Tfn修饰密度更大，这一差异在低密度Tfn修饰的Tfn/PCL胶束纯化中表现尤为明显。差异原因主要是与两种方法的分离纯化原理相关。Tfn修饰胶束一般根据所需的修饰密度进行投料，Tfn会稍过量，通过成酰胺反应连接到胶束表面，反应结束后将未反应的Tfn、其他过量或者反应生成的小分子化合物去除，即得Tfn修饰的纳米递送系统［8］。超滤法的原理是膜分离截留技术［13］，利用待分离纯化物质的分子量差异，截留溶液中的大分子物质，将相对分子量小的物质滤过除去。而葡聚糖凝胶法利用分子排阻色谱原理［14］，小分子物质可自由进入凝胶内部而被截留，大分子物质因不能进入凝胶内部，则很快通过滤柱进入滤出液中。Tfn/PCL胶束随着表面Tfn修饰密度的不同，分子大小存在差异。超滤法的膜截流技术对于该差异不敏感，尤其在低密度Tfn/PCL胶束的分离纯化中，对于修饰的和未经修饰的胶束均会截留，所得产物为Tfn修饰和未修饰两种PCL胶束的混合物；而葡聚糖凝胶法分离的原理是利用分子在凝胶柱中的移动速率的差异，因此，随着通过葡聚糖凝胶柱纯化次数的增多，Tfn修饰的PCL胶束的比例会相应增加，表现在Tfn修饰密度上，即Tfn修饰密度呈现增加趋势。两种方法在高密度Tfn/PCL胶束的纯化中差异不明显，而在低密度Tfn/PCL胶束的纯化中表现出明显差异。葡聚糖凝胶法分离所得的Tfn/PCL胶束与超滤法获得的胶束相比，前者纯度较高。另外，从操作以及成本等方面来看，超滤法操作相对更为简单便捷，但超滤管价格相对昂贵，理论上不可重复利用，浓缩后会有部分胶束残留在膜上，收集不完全。葡聚糖凝胶法操作相对复杂，但价格相对便宜，且一定程度上可重复利用葡聚糖凝胶。文献［15］报道，给药系统表面配体的修饰密度对于主动靶向药物递送系统的靶向效率具有显著影响。本文以自制的Tfn修饰的胶束为研究对象，考察比较了两种纯化方法——超滤法和葡聚糖凝胶法，二者的纯化效率相近，但葡聚糖凝胶法纯化后获得的Tfn/PCL胶束更纯，表面Tfn修饰密度更大，这一差异在Tfn/PCL低胶束纯化中表现尤为明显。本文的研究结果将为今后Tfn修饰的纳米药物递送系统的设计，以及诸如此类的配体修饰的纳米递送系统的构建提供参考。