哮喘是一种与免疫因素密切相关的复杂性疾病，具体致病机制至今未明。巨噬细胞在受到一定刺激后可分化为M1或M2亚型［1］。M1细胞在辅助T细胞（helper T cell，Th）1细胞因子如γ-干扰素（interferon gamma，IFN⁃γ）等刺激下诱导生成，表面高表达Toll 样受体（Toll-like receptors， TLRs）4、分化群（cluster of differentiation， CD）80、 诱导型一氧化氮合酶 （nitric oxide synthase，NOS）2等。M2细胞在Th2细胞因子如白介素（interleukin， IL）-4和IL-13刺激下诱导生成，表面高表达CD206、精氨酸酶 1（arginase-1，Arg-1）［2］，而Th1/Th2平衡向Th2漂移已被证实在哮喘的气道免疫炎症中发挥重要作用［3］。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells， BMSCs）具有组织修复和免疫调控等功能。在哮喘炎症过程中，BMSCs由CXC趋化性细胞因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor4， CXCR4）/人基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1， SDF-1）轴趋化归巢至受损肺组织，并通过调节Th1/Th2失衡发挥免疫调节和修复损伤作用［4］。这一过程受微小RNA139（microRNA139，miR-139）/缺口受体 1（notch homolog 1，Notch1）轴调控［5］。该研究基于miR-139/Notch1轴调控巨噬细胞极化观察其对哮喘大鼠BMSCs归巢的影响，旨在深入探讨BMSCs在哮喘过程中发挥免疫调节的具体机制。1材料与方法1.1实验材料清洁级雄性SD大鼠36只，体质量160~220 g，（20±2）oC和12 h光照-黑暗循环条件下分笼适应性饲养1周左右。大鼠由安徽医科大学实验动物管理中心提供，动物生产许可证号：SCXK（皖）2017-001，动物伦理由安徽中医药大学动物伦理委员会批准（批号：AHUCM-rats-2021131）。显微镜（日本Olympus公司，型号：CKX41）； 超声雾化器（上海鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：鱼跃402B）；流式细胞仪（美国BD公司，型号：FC500）；荧光定量 PCR仪（美国Thermo Scientific公司，型号：PIKOREAL 96）。瑞氏染色剂溶液、卵清蛋白（ovalbumin，OVA），5，6-羰基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（ 5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE）（上海希格玛高技术有限公司，货号：45253-250ML-F、A5503-10G、21888-25MG-F） ；SYBR qPCR SuperMix Plus（上海近岸科技有限公司，货号：E096-01B）；逆转录酶（日本TaKaRa公司，货号：RR047A）；IFN-γ、IL-13、CD80、CD206 ELISA试剂盒、胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、链酶蛋白酶（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：SEKM-0031、SEKM-0046、P00473、K006619P、F8240-100、P8360）。1.2实验方法1.2.1实验分组将30只SD雄性大鼠，随机分为3组，每组10只，分别为正常对照（NC）组、模型对照（MC）组、BMSCs植入（BMSCs）组。1.2.2BMSCs分离、培养及标记分离培养：取4周龄SD雄性大鼠6只，脱颈处死。无菌条件下，去除股骨和胫骨附着的肌肉和结缔组织。切除骨末端，暴露骨髓腔，予含2 %胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的磷酸缓冲液（phosphate buffered saline， PBS）溶液反复冲洗髓腔，过滤，收集细胞，吹打呈单细胞悬液。悬液离心（1 000 r/min）5 min，弃上清液，重新悬浮细胞，并接种于25 cm2培养瓶（初始密度1×106 个/mL），置于细胞培养箱培养。更换培养基3～4 d/次，观察BMSCs形态变化，待细胞融合至80%～90%，37 oC条件下，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）消化 3~5 min后终止消化，1∶2传代细胞。第3~5代细胞备用于后续实验。荧光染料标记：避光条件下，将50 μg CFSE溶解于18 μL DMSO，配成5 mmol/L的原液。取第3~5代细胞5×106个悬浮于2 mL 0.1% BSA内，加入2 μL CFSE原液，置于37 oC孵育10 min；加4倍体积FBS终止反应，室温孵育5 min；PBS室温洗涤3次，第2次结束后置于37 oC孵育5 min，加入等量的FBS停止反应，重悬1×106个细胞于1 mL PBS，备用于实验。1.2.3哮喘模型建立采用致敏3周和激发6周两个阶段，形成慢性哮喘大鼠模型。于造模第0、7、14天分别予10 % OVA（含10 mg OVA和100 mg氢氧化铝的无菌抗原液）1 mL致敏。自第21天起，予1% OVA雾化30 min，隔日激发1次，持续6周。NC组给予生理盐水替代以相同方法处理。1.2.4BMSCs在哮喘大鼠肺组织的表达将有CFSE标记的BMSCs（1×106个/mL）自尾静脉输注至哮喘大鼠体内，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h处死大鼠，采用流式细胞术检测CFSE标记的BMSCs在肺组织中的表达情况。1.2.5炎性细胞比例的测定模型复制成功后，采用瑞氏-吉姆萨染色：用瑞氏-吉姆萨染液A溶液盖满涂片标本，染色30 s，再加入瑞氏-吉姆萨染液B溶液（溶液体积为A的2~3倍），染色1~3 min，倾去染液，蒸馏水洗净，快速烤干。显微镜镜检：先用低倍镜扫视全片，查找目标部位，再换油镜鉴定并分类计数，每组随机抽取6张片子，随机计数100个细胞，报告嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）、中性粒细胞（neutrophil，N）、单核细胞（monocyte，M）、巨噬细胞（macrophage，MΦ）百分数。1.2.6ELISA法检测大鼠血清巨噬细胞极化细胞因子IFN-γ、IL-13、CD80、CD206变化模型复制成功后，采用ELISA 法检测大鼠血清中IFN-γ、IL-13、CD80、CD206的含量。实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。1.2.7RT-qPCR检测肺组织miR⁃139、Notch1、巨噬细胞极化标志物相关因子NOS2、Arg1及归巢标志物CXCR4、SDF⁃1 mRNA表达模型复制成功后，取适量肺组织剪碎研磨，加入预冷的 TRIzol 溶液提取总RNA，采用紫外分光光度法检测 RNA分子量和纯度。将确认纯度的总RNA加入反转录反应液， 42 ℃孵育60 min合成cDNA。以 cDNA作为荧光定量的模板进行扩增，严格按照 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒说明书操作，将各试剂混匀，上机检测。使用2－ΔΔCT方法计算miR⁃139、Notch1、NOS2、Arg1及归巢标志物CXCR4、SDF⁃1的mRNA相对表达量。1.3统计学处理采用SPSS 26.0统计软件对数据进行统计分析，结果用x¯±s表示，组间比较进行t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1BMSCs在哮喘大鼠肺组织的动态变化将由荧光染料CFSE标记后的BMSCs经尾静脉注射入哮喘大鼠体内后，采用流式细胞术追踪不同时间节点肺组织中CFSE的荧光强度，由此判断荧光标记BMSCs在哮喘大鼠肺组织的动态变化。检测显示，12 h起始荧光强度为（5.124±1.415）%，荧光强度在肺组织的表达随时间推移呈逐渐上升趋势，至72 h表达量达到最高值（18.144±5.170）%，而后逐渐下降，于120 h达到最低点（4.266±1.128）%。表明同源异体BMSCs经尾静脉注射入哮喘大鼠体内后可向肺组织迁移。见图1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1CFSE标记的BMSCs在肺组织中的示踪Fig. 1Tracking of BMSCs tagged with CFSE in lung tissue2.2炎性细胞比例的测定结果与NC组比较，MC组N、EOS、M比例升高（t=4.87、12.47、5.17，均P0.01），MΦ比例降低（t= 9.01，P0.01）。与MC组比较，BMSCs组N、EOS、M比例降低（t=2.51、6.56、2.14，均P0.05），MΦ比例升高（t=5.02，P0.01）。说明在哮喘模型中炎性细胞表达呈现升高趋势。见图2。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2肺泡灌洗液中炎性细胞计数的比较Fig. 2Comparison of inflammatory cell counts in alveolar lavage fluid**P0.01 vs NC group； #P0.05， ##P0.01 vs MC group.2.3大鼠血清巨噬细胞极化细胞因子IFN-γ、CD80、IL-13、CD206变化与NC组比较，MC组大鼠血清IFN-γ、CD80表达降低（t=5.99、t=5.10，均P0.01），IL-13、CD206表达升高（t= 8.41、t=8.75，均P0.01）。经BMSCs注射后，与MC组比较，BMSCs组IFN-γ（t= 3.13，P0.01）表达升高，IL-13、CD206表达降低（t=6.71、 3.07，均P0.01）。提示在哮喘模型中存在巨噬细胞极化，哮喘过程中存在Th1/Th2细胞失衡的情况。见图3。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3各组血清巨噬细胞极化细胞因子IFN-γ、CD80、IL-13、CD206表达比较Fig.3The expression of serum macrophage polarization cytokines IFN-γ， CD80， IL-13， and CD206 in each group**P0.01 vs NC group；##P0.01 vs MC group.2.4肺组织miR-139、Notch1、巨噬细胞极化标志物相关因子NOS2、Arg1及归巢标志物CXCR4、SDF⁃1 mRNA表达与NC组比较，MC组大鼠肺组织miR-139（t=4.01，P0.01）表达降低，NOS2、Arg1、CXCR4、Notch1 mRNA升高（t=33.01、26.14、5.76、6.25，均P0.01）。经BMSCs注射后，与MC组比较，BMSCs组miR⁃139、CXCR4、SDF⁃1 mRNA表达升高（t=5.32、6.10、6.35，均P0.01），Notch1、NOS2、Arg1 mRNA降低（t=4.60、5.20、4.74，均P0.01）。提示在哮喘中肺组织中miR⁃139、Notch1表达失衡时，伴随巨噬细胞极化标志物相关因子和归巢标志物基因表达出现紊乱，miR⁃139可能参与哮喘归巢的过程。见图4。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4肺组织miR-139、Notch1、NOS2、Arg1及归巢标志物CXCR4、SDF-1基因表达Fig.4The expression of miR-139， Notch1， NOS2， Arg1， and homing markers CXCR4 and SDF-1 genes in lung tissue**P0.01 vs NC group； ##P0.01vs MC group.2.5归巢标志物CXCR4、SDF-1与相关指标的相关性分析在哮喘模型中，通过对肺组织归巢标志物CXCR4、SDF⁃1 mRNA与miR⁃139、Notch1、巨噬细胞极化标志物相关因子NOS2、Arg1、IL⁃13、CD80相关性分析显示，CXCR4与miR⁃139呈正相关（P0.05），CXCR4与Notch1呈负相关（P0.05）。SDF⁃1与IFN⁃γ呈正相关（P0.05），SDF⁃1与Arg1、CD206呈负相关（P 0.05）。见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1归巢标志物CXCR4、SDF⁃1与相关指标的相关性（r）Tab.1Correlation between homing markers CXCR4， SDF⁃1 and related indicators （r）Index of homing markersOther indicatorsmiR⁃139Notch1NOS2Arg1IFN⁃γIL⁃13CD80CD206CXCR40.655*-0.697*0.0550.3450.055-0.1030.394-0.030SDF⁃10.309-0.4670.042-0.652*0.614*-0.4180.055-0.623** Indicates that the correlation coefficient P0.05.3讨论哮喘是由多种炎症细胞及细胞组分参与，以慢性气道炎症为特征的异质性疾病［6］。巨噬细胞作为气道中最常见的免疫细胞类型，巨噬细胞极化已被证明是哮喘发病机制中的一个重要环节［7］。当其受到Th1细胞因子刺激时，可向M1型巨噬细胞极化，表现为高表达CD86、CD80、TLRs4、NOS2等因子［8］。在Th2细胞因子（IL-13、IL-4）等诱导下，又可向M2型巨噬细胞极化，表现为高表达CD163、Arg-1、CD206等，发挥免疫调节功能［9］。在机体受到外界因素影响时，两种细胞分布和比例间的动态平衡会被打破，导致炎症反应失衡，甚至炎症因子风暴［10］。故而，巨噬细胞极化在以慢性炎症为主要特征的哮喘过程中发挥重要作用。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺泡灌洗液中的N、EOS、M比例升高，MΦ比例下降，表明在哮喘发生过程中，巨噬细胞的数量发生变化，这可能与巨噬细胞极化有关。M1/M2型巨噬细胞间的动态平衡亦发生变化，即巨噬细胞向M2型细胞极化，M1型巨噬细胞减少，这种动态失衡进一步加剧Th2炎症反应，随着Th2促炎细胞因子的增多，嗜酸性粒细胞等炎症细胞的浸润，造成或加剧了哮喘的气道免疫炎症。BMSCs作为免疫调节剂，可通过调节哮喘过程中的Th1/Th2细胞失衡而缓解气道炎症［11–13］。在一定条件下，趋化BMSCs沿浓度梯度向着缺血缺氧的目标组织定向迁移［14–15］。在众多调控BMSCs的增殖、迁移等生化因子中，SDF-1起着关键作用，BMSCs 表面表达的CXCR4是SDF-1的特异性结合受体［16］。组织处于受损或低氧缺血状态时，SDF-1的表达量可明显上调并与CXCR4结合，诱导BMSCs沿着SDF-1的浓度梯度归巢至受损组织发挥作用。本研究结果显示，将荧光标记同源异体的BMSCs植入哮喘模型大鼠体内后，其可向受损肺组织归巢，且在植入后72 h归巢率达到最高，这为其在哮喘过程发挥免疫作用提供基础。miRNAs已被证明可以调节BMSCs的多种分化和免疫调节功能［17］。课题组在前期研究［18］中显示，Notch1作为miR-139的靶基因，二者存在结合位点，Notch1信号通路在miR-139诱导的细胞凋亡、迁移、侵袭等过程中发挥关键作用［19］。且既往本课题组［20］亦发现，采用γ-促分泌酶抑制剂阻断 Notch1信号通路，可促进BMSCs归巢能力。同时，Notch1信号通路与哮喘Th1/Th2细胞因子分化关系密切，而巨噬细胞极化的调节过程涉及Th1/Th2各种细胞因子、趋化因子、转录因子和免疫调节细胞之间复杂的相互作用，其中就包括miRNA对信号通路的调控作用［21］。故而推测miR-139/Notch1对哮喘BMSCs归巢的调控可能存在巨噬细胞极化的参与。本研究相关性分析结果亦提示CXCR4与miR⁃139呈正相关，CXCR4与Notch1呈负相关。以上结果说明抑制Notch1通路可提高BMSCs归巢能力，而这一过程有miR-139的参与。miR-139可能通过影响Notch1信号通路间接调控CXCR4、SDF-1。通过miR-139抑制下游Notch1通路可增加BMSCs表面受体CXCR4水平，从而促进其归巢。本研究相关性分析结果显示，M2型巨噬细胞与BMSCs向哮喘肺组织的归巢有关。BMSCs在炎症条件下被细胞因子和免疫细胞分泌的因子激活。巨噬细胞作为参与炎症反应的重要因素，M1型巨噬细胞诱导BMSCs细胞凋亡，M2型巨噬细胞可促进BMSCs的迁移和增殖［22］。而本次研究结果显示，MC组大鼠血清CD80、IFN-γ表达降低，IL-13、CD206表达升高，且SDF-1与IFN-γ呈正相关，SDF⁃1与Arg1、CD206呈负相关。说明巨噬细胞M1/M2动态平衡被打破，释放Arg1、IL-13 等炎性细胞因子，参与哮喘气道炎症反应，并可能由此参与BMSCs向哮喘肺组织中的归巢。综上所述，哮喘炎症过程中，miR-139/Notch1通路对BMSCs归巢的调控可能存在巨噬细胞极化的参与，这一发现有助于深入了解哮喘BMSCs归巢机制，为BMSCs免疫调节哮喘炎症提供新思路。