急性髓性白血病（acute myeloid leukemia， AML）是一种髓系来源的造血干细胞的恶性克隆性疾病，其特征是骨髓内异常细胞的快速增殖并同时伴感染、贫血和出血等症状［1］。全球每年有8万多人死于AML，由造血功能异常引起的一系列血液变化是其主要死亡原因［2］。近年来治疗手段不断进步，M3型AML在临床已有较好治疗方案且早期完全缓解（complete response， CR）率可达90%以上，但是非M3型患者预后仍不理想，大多数患者依然面临着复发、难治，最终病情进展恶化的问题，新型有效的治疗靶点有待进一步探索。三基序蛋白（tripartite motif-containing protein， TRIM）家族是一类进化上保守的蛋白质［3］，在肿瘤发生的早期阶段，代谢重编程、肿瘤微环境变化以及活性氧失衡等一系列因素可促进细胞发生恶性转化［4］。TRIM28，又称KRAB相关蛋白1（KRAB-associated protein 1 ， KAP1） ［5］，是TRIM家族的重要成员。TRIM28在胚胎干细胞及多种肿瘤中表达升高，可调节细胞分化及凋亡在内的多种细胞功能［6］， 被认为是白血病的有效治疗靶点［4］。该研究旨在检测TRIM28在非M3型AML患者中的表达水平，并探讨其在非M3型AML中的预后意义。1材料与方法1.1研究对象纳入2020年4月至2025年6月在安徽医科大学第二附属医院诊断为非M3型AML的患者75例，4例治疗无缓解（non-remission， NR）患者未纳入表1，无先天性/获得性免疫缺陷。选取20例骨髓检查无异常的缺铁性贫血（iron deficiency anemia， IDA）患者作为正常对照骨髓标本。根据WHO（2016）MICM分类诊断的患者分为初诊（new diagnosis， ND）、CR和复发难治（relapsed refractory， RR）。这些患者的详细临床资料见表1。本研究经安徽医科大学第二附属医院医学研究伦理委员会批准（批号：SL-YX［YS］2023-SZR 039）。所有参与研究的患者均签署了知情同意书。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1非M3型AML患者特征Tab.1Characteristics of non-M3 AML patientsState of disease at sample drawIDANDCRRRNumber of patients （n）20271529Male ［n （%）］8 （40.00）12 （44.44）6 （40.00）14 （48.28）Female ［n （%）］12 （60.00）15 （55.56）9 （60.00）15 （51.72）Average age ［Mean （Range），years］46.2 （35-68）59.1 （20-85）52.2 （16-72）51.2 （16-82）1.2主要试剂与仪器1640 RPMI培养基 （上海源培生物科技股份有限公司，货号：L210KJ），细胞总RNA快提试剂盒（广州信天翁生物科技有限公司，货号：400-100），ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR、2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix （Universal） （上海吐露港生物科技有限公司，货号：22107、22204），BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010S、C0041） ，ECL化学发光剂（美国Thermo Fisher 公司，货号：34577），AnnexinⅤ-APC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，货号：BB-41033）。TRIM28和GAPDH 的PCR引物（南京擎科生物科技有限公司），GAPDH Rabbit pAb、TRIM28 Rabbit pAb（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：AC001、A2245），山羊抗兔IgG HRP（合肥麦客生物科技有限公司，货号：BL101A）。实时荧光定量PCR（上海罗氏诊断产品有限公司，型号：Light Cycler480），凝胶成像仪（广州博鹭腾生物科技有限公司，型号：GelView 6000 ProⅡ），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，型号：Cyto Flex）1.3骨髓单个核细胞提取用肝素抗凝管采集血液样本，1 500 r/min离心5 min，弃去上层血浆。将剩余沉淀与等体积无菌PBS混匀，转入15 mL离心管。将稀释后的血样小心加入至淋巴分离液上层，2 000 r/min离心30 min（升降速均设为1），离心后分为4层。取第2层淋巴细胞白环层至含生理盐水的离心管中，1 500 r/min离心10 min，获得单核细胞沉淀。1.4实时定量PCR收集上述单个核细胞，用细胞总RNA快提试剂盒提取总RNA，用分光光度计测定浓度，用DEPC水校准。将该RNA作为反转录模板，得到的cDNA进行qPCR扩增，以GAPDH作为内参检测TRIM28 mRNA的相对表达水平。采用2-ΔΔCT方法计算TRIM28相对表达量，基因引物序列如表2所示。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T002表2用于qPCR引物的引物Tab.2Primers used for qPCRNameSequence （5′⁃3′）GAPDH⁃ForwardAGCAAGAGCACAAGAGGAAGGAPDH⁃ReverseGGTTGAGCACAGGGTACTTTTRIM28⁃ForwardGCGGAAATGTGAGCGTGTATRIM28⁃ReverseCCTGGGCAAACTCCTGT1.5蛋白质免疫印迹法取生长状态好的细胞收集沉淀，加入适量细胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取蛋白，并进行 BCA蛋白定量分析，提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行转膜，用脱脂牛奶封闭2 h；封闭结束，洗膜后进行抗体孵育。一抗如表3所示。暴露于ECL后，使用ImageJ软件进行灰度值分析。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T003表3Western blot所用一抗Tab.3Primary antibodies used for Western blotAntibodyCompanyCatalog numberGAPDH Rabbit pAbABclonalAC001KAP1/TRIM28 Rabbit pAbABclonalA22451.6细胞复苏和培养将冻存的HL-60细胞在37 ℃水浴锅中解冻然后在室温下用PBS缓冲细胞，在800 r/min下离心5 min以去除冻存液，然后在含有10% FBS的RPMI-1640 培养基中重悬，转移到T25培养瓶中，培养温度为 37 ℃，CO2浓度为5%。1.7si-RNA转染取生长状态良好的细胞，以每孔2×105个细胞/400 µL的密度接种于24孔板中。用培养基稀释4种不同序列的病毒和转染剂lip3000。将稀释后的病毒加入稀释后的lip3000中，得到最终的转染液，室温孵育20 min。每孔加入转染液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。在24~48 h通过qPCR验证转染效率，在48~72 h通过蛋白水平验证转染效率。1.8CCK-8实验每组细胞在1 500 r/min下离心5 min，获得细胞沉淀，将含10% FBS的完全培养基重悬细胞。按照每孔6 000个/100 µL的体系接种于96孔板中。每组细胞重复5个复孔，分别于0、24、48、72 h加入10 µL CCK-8溶液，然后在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1~2 h。在450 nm波长处测量每组每孔细胞的吸光度值A，记录数据并计数。1.9凋亡检测采集细胞并计数。每组取104个细胞置于流式管中，1 500 r/min离心5 min，丢弃上清液，在PBS中洗涤1～2次。将细胞重悬于100 µL Annexin V结合液中，然后加入1 µL Annexin V- APC染料溶液，轻轻混合，4 ℃孵育15 min，加入1 µL PI染料溶液，轻轻混合，4 ℃孵育5 min。最后，用流式细胞仪测定。1.10GEO数据库和GEPIA2数据库通过R语言4.4.1 GEO query包获取GSE34577数据集，并对原始数据进行背景校正和归一化，从标准化后的表达矩阵中提取TRIM28基因的表达数据，筛选出TRIM28基因在正常人样本和非M3型AML患者中的表达数据并导出数据，将此数据导入Graphpad Prism 9.5软件中进行统计分析。利用在线网站GEPIA2数据库，选择生存分析，输入TRIM28基因名并选择AML，进行在线分析。1.11统计学处理使用Graphpad Prism 9.5和Origin 2018对得到的实验数据进行统计分析和制图。在统计分析之前，对每组数据先进行正态性分析。对于符合正态性分布的两组数据之间的比较，使用t检验；对于不符合正态分布的，则使用非参数秩和检验。多组间数据比较，如果满足正态分布条件，则采用One-way ANOVA进行分析，并在发现统计学差异时采用Tamhane's T2 test法进行两两组间的比较；若不符合正态分布，则使用Kruskal-Wallils H检验，并在有统计学差异时进一步采用Mann-Whitney U检验进行两两组间的比较。以P0.05为差异有统计学意义。使用线性回归分析统计TRIM28水平与临床指标的相关性，当P0.05 时，表示变量间的线性关系具有统计学意义。Pearson相关系数（r）的绝对值越大，说明相关性越强，方向由其正负号决定。2结果2.1TRIM28在非M3型AML患者中上调为了探讨TRIM28在非M3型AML中的作用，本研究利用GEO数据库GSE34577数据集分析TRIM28的表达，结果显示TRIM28在非M3型 AML患者中的表达水平明显高于对照组（P0.000 1）（图1A）。采用qPCR检测TRIM28在临床非M3型AML患者骨髓细胞中的表达。由于健康对照的骨髓标本难以获得，本研究选取IDA患者的骨髓标本作为对照。结果显示，TRIM28在非M3型AML患者中的表达高于IDA组，且有统计学差异（P0.000 1）（图1B）。此外，TRIM28在ND组和RR组中的表达高于IDA组（q=3.791、3.971，P0.05）（图1C），但TRIM28的表达高低与AML类型之间的差异无统计学差异（图1D）。以2025年NCCN治疗指南为参考依据，按照染色体核型与基因突变结果进行预后分层，对患者的TRIM28表达与预后分层进行相关性分析，结果表明TRIM28在遗传学风险预后分层为中等和不良组的患者中的表达高于预后良好组的患者（t=2.790、2.318，P0.05）（图1E）。对患者的基因突变进行进一步分析，结果如表4所示，TRIM28的表达在NPM1突变患者中升高，组间差异有统计学意义（Z=-2.003， P=0.044 9），但是根据指南表示，NPM1单突变是预后良好因素，NPM1突变合并FLT3-ITD突变患者预后较差，因此将NPM1突变组的患者分为NPM1单突变组和NPM1合并FLT3⁃ITD突变组，统计学分析结果表明TRIM28的表达在NPM1合并FLT3⁃ITD突变患者中升高，但TRIM28的表达高低与NPM1单突变无明显相关性（表5）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1TRIM28在AML患者中的表达水平Fig.1The expression levels of TRIM28 in AML patientsA： The expression level of TRIM28 between non-M3-AML samples and normal samples in GEO database； B： Comparison of TRIM28 expression levels in IDA and AML patients in clinical samples； C： Comparison of TRIM28 expression levels between IDA and different group AML patients； D： Comparison of TRIM28 expression levels between IDA and AML patients with different FAB subtypes； E： Comparison of TRIM28 expression levels in AML patients with different genetic risk prognostic strata； ****P0.000 1 vs Normal group； #P0.05， ####P0.000 1 vs IDA group； &P0.05 vs Favorable group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T004表4TRIM28 mRNA 表达与非M3型AML 患者基因突变的关系Tab.4Association of TRIM28 mRNA expression with gene mutations in non-M3 AML patientsGenetic mutationn （Total=63）TRIM28 ［M （P25， P75）］Z valueP valueFLT3-ITD mutation statusMutant144.312 （1.721， 12.970）-0.6780.507 3Non-mutant493.805 （0.699， 8.593）NPM1 mutation statusMutant99.894 （3.746， 14.370）-2.0030.044 9Non-mutant542.553 （0.471， 7.810）ASXL1 mutation statusMutant22.752 （0.122， 5.381）-0.6660.541 7Non-mutant613.805 （1.259， 9.353）RUNX1 mutation statusMutant64.772 （1.368， 12.210）-0.3980.706 2Non-mutant573.805 （1.128， 8.707）CEBPα mutation statusMutant71.295 （0.186， 20.620）-0.5250.614 6Non-mutant564.027 （1.345， 8.760）TET2 mutation statusMutant40.838 （0.116， 17.070）-0.9020.389 1Non-mutant593.884 （1.278， 8.813）TP53 mutation statusMutant31.886 （0.114， 5.381）-0.8710.410 7Non-mutant603.844 （1.250， 9.624）DNMT3A mutation statusMutant72.679 （1.295， 7.552）-0.3060.772 6Non-mutant564.027 （1.071， 9.624）ETO mutation statusMutant54.595 （2.189， 13.570）-0.7120.495 8Non-mutant583.543 （1.185， 8.924）KIT mutation statusMutant74.595 （1.919， 8.813）-0.7220.485 4Non-mutant563.543 （1.071， 9.571）IDH2 mutation statusMutant81.773 （1.084， 6.898）-0.7640.458 4Non-mutant553.884 （1.241， 9.894）10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T005表5NPM1单突变与NPM1合并FLT3⁃ITD突变患者TRIM28 表达水平的比较Tab.5Comparison of TRIM28 expression between patients with NPM1 mutation alone and those with NPM1 plus FLT3⁃ITD mutationGroupnTRIM28 ［M （P25， P75）］Compare the P value with Non-mutantCompare the P value with NPM1 mutantionNPM1 mutation22.409 （1.014， 3.805）0.804NPM1 with FLT3-ITD mutation712.870 （4.938， 15.450）0.0470.184Non-mutant542.553 （0.471， 7.810）0.8042.2非M3型AML患者TRIM28水平与临床指标的相关性分析在验证TRIM28在非M3型AML患者中的表达后，分析TRIM28表达水平与各项临床指标包括ND患者年龄、骨髓原始细胞（bone marrow blast， BM-blast）百分比、外周血原始细胞（peripheral blood blast， PB-blast）百分比、白细胞计数（white blood cell count， WBC count）、血红蛋白计数（hemoglobin count， HB count）、血小板计数（platelet count， PLT count）、白蛋白（albumin， ALB）、铁蛋白（ferritin， FE）以及乳酸脱氢酶水平（lactate dehydrogenase， LDH）之间的相关性。结果显示，TRIM28表达水平与年龄（图2A， r=0.504 7， P=0.023 2）、BM-blast比例（图2B， r=0.548 2， P=0.012 3）、PB-blast比例（图2C， r=0.637 2， P=0.001 4）、白细胞计数 （图2D， r=0.536 4， P=0.026 5）呈正相关；与血红蛋白 （图2E， r= -0.462 8， P=0.030 1）呈负相关，与血小板 （图2F）、乳酸脱氢酶（图2G）、铁蛋白（图2H）、白蛋白（图2I）无相关性（均P0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2非M3型AML患者TRIM28表达水平与临床的相关性分析指标Fig.2Correlation analysis between TRIM28 expression level of non-M3 AML patients and clinical indicatorsA-I： Correlation analysis between TRIM28 expression level with Age， BM-blast， PB-blast， WBC count， HB count， PLT count， LDH， FE and ALB level of non-M3 AML patients in ND group.2.3TRIM28水平与非M3型AML患者的治疗反应率和预后相关此外，收集首次诱导化疗CR患者和治疗无反应（non-response，NR）的患者的临床数据，并分析首次诱导化疗的治疗效果与TRIM28的相关性。结果显示，无反应组患者的TRIM28表达高于治疗有反应组（图3A， P0.01）。随后，利用GEPIA2数据库验证了高TRIM28表达的非M3型AML患者的长期生存率较差（图3B， HR=2.9， P=0.045）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3非M3型AML患者TRIM28水平与治疗有效率及预后的关系Fig.3Relationship of TRIM28 level and treatment response rate and prognosis in non-M3 AML patientsA： Relationship between TRIM28 levels and treatment response rates of patients with non-M3 AML； B： Kaplan-Meier curves of TRIM28 on survival in GEPIA2 database； **P0.01 vs CR group.2.4干扰TRIM28抑制AML细胞增殖，促进细胞凋亡为了探讨TRIM28水平对AML细胞功能的影响，使用了小干扰RNA技术（siRNA）干扰HL60细胞TRIM28。如图4A-4C所示，不同序列转染后，TRIM28的mRNA表达水平（t=6.68、12.02 、10.76、4.17，均P0.05）和蛋白表达水平均有不同程度的下降（t=16.25、33.44、37.05、7.470，均P0.05）。根据转染效率，选择S2、S3序列下降程度最高，因此用于后续实验。CCK-8结果显示，转染后HL60细胞的增殖能力下降（图4D，q=2.92、3.37，均P0.05）。此外，通过流式细胞术检测TRIM28水平对凋亡比例的影响，发现干扰TRIM28后细胞凋亡比例增加（图4E，q=4.76、4.68，均P0.01）。上述结果表明，干扰TRIM28的表达可抑制HL60细胞的增殖，促进细胞凋亡。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4干扰TRIM28效率验证及对AML细胞增殖和凋亡的影响Fig.4Interference with TRIM28 efficiency validation and its effects on AML cell proliferation and apoptosisA-C： The expression of TRIM28 mRNA and protein in HL60 cells treated with different interfering sequences； D： The effects of interfering with TRIM28 on the proliferation of HL60 cells； E： The effects of interfering with TRIM28 on The apoptosis of HL60 cells； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs NC group.3讨论AML是一种危害人类健康的血液系统恶性疾病，其发病率和病死率在白血病中居首位［2］，但大多数AML病例病因尚不明确。尽管在治疗AML方面取得了一些有希望的进展，但AML患者的预后仍然不令人满意，其中一半以上的患者最终死于疾病。因此，探索新的治疗靶点是非常必要的。TRIM28作为一种转录调节因子，在肿瘤生物学中具有多种作用，如在肺癌中，TRIM28 可与泛素连接酶RLIM相互作用，促进其泛素化，维持p53的低表达水平，最终促进肿瘤细胞的增殖和生存［8］。有研究［9］报道，在肝细胞癌中，细胞核中的 TRIM28与泛素偶联酶E2家族的成员UBE2S相互作用，增强p27的泛素化并促进其降解，从而调节肝细胞癌细胞的细胞周期进程。它能促进卵巢癌的迁移、侵袭和上皮间质转化过程［5， 10］。此外，TRIM28还参与了肿瘤细胞的凋亡［11］和自噬［12］过程。然而，其在AML中的表达和分子作用研究较少。本研究在GEO数据库GSE34577中验证了非M3型AML样本中TRIM28的表达水平，结果显示其在AML中显著高于对照组。进一步检测TRIM28在临床非M3型AML骨髓样本中的表达，以IDA患者的骨髓样本为对照组。qPCR结果与数据库结果一致，显示非M3型AML组TRIM28表达水平高于IDA组，而不同FAB亚型AML患者之间无统计学差异，根据2025年NCCN治疗指南进行遗传学风险分层，结果发现TRIM28 在中等和不良预后组患者中的表达高于良好预后组。基因突变分析显示，TRIM28在NPM1突变患者中表达升高，但进一步分组发现，这种高表达主要出现在NPM1合并 FLT3-ITD 突变患者，而在NPM1单突变患者中无显著差异。提示 TRIM28 高表达可能与NPM1合并FLT3-ITD所代表的不良预后特征相关。此外，ND组的TRIM28表达水平高于CR组和RR组；这在一定程度上表明TRIM28在AML发病阶段起着关键作用。相关性分析结果显示，TRIM28表达水平与患者年龄、ND时外周血和骨髓原始细胞比例、白细胞计数呈正相关。结合2022年欧洲白血病联盟建议，预测AML初诊断时TRIM28的高表达可能与不良预后相关。此外，在随访结果统计中，发现首次诱导化疗失败的NR患者中TRIM28的表达高于首次诱导化疗成功的患者。结合生存分析结果显示TRIM28高表达组患者的长期生存较差，最终得出TRIM28高表达与不良预后密切相关。为了进一步阐明TRIM28水平对AML细胞功能的影响，采用小干扰技术干扰TRIM28的表达水平。实验结果表明，TRIM28敲低后，AML细胞增殖能力降低，凋亡比例增加。出现这一现象可能是因为TRIM28可以维持癌细胞的干性，并作为E3泛素连接酶发挥作用，促进细胞增殖或抗增殖活性［13］。一项在胃癌中的研究［14］提示，TRIM28通过调控泛素化过程，增加程序性死亡受体-配体1（PD-L1）表达，并抑制T细胞活化以促进肿瘤生长。Tan et al［15］研究结果显示，TRIM28可通过上调miR-125b-5p，抑制CREB1表达，从而诱导顺铂耐药。这些虽源自其他肿瘤，但与本研究观察到的AML细胞中TRIM28的表达影响肿瘤细胞生存的现象高度一致。