胆管细胞癌（cholangiocarcinoma， CHOL）发病率较低，在所有肝脏癌症中所占比例大约为十分之一［1］。研究［2］表明由于缺乏有效的早期检测方法以及这种疾病具有强异质性，常见的化疗、放疗和靶向治疗等手段对CHOL的治疗效果较差，术后5年的总生存率低于半数。因此，对CHOL发病机制及其演化过程进行深入探索，不仅能够促进新型诊断指标的开发，还有助于设计出更加精准的治疗方案。SKI基因位于1号染色体的短臂上，该基因包含三个特定的功能区域：Dachshund同源域、SAND-L结构域以及多个卷曲螺旋结构域［3］。已有研究［4–5］表明，SKI突变与Shprintzen-Goldberg综合征和马方综合征等疾病的发生密切相关。然而，关于SKI突变在胆管细胞癌发生过程中的影响及其分子机制，目前的研究尚不充分，仍需进一步深入探索［6］。因此，该研究旨在深入探讨SKI异常表达及其突变在胆管癌病理过程中所发挥的具体生物学功能及其潜在机制。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞系与载体本研究采用的细胞系主要包括源自人类胆管癌QBC939、RBE细胞系和人胚肾细胞系HEK293T（来自本实验室细胞库）。在固定条件为37 ℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。载体包括用于基因过表达及其突变体的pLV-3×Flag-mCherry（2A）Puro-SKI-WT、pLV-mCherry（2A）Puro-SKI-Mut （539C T）和对照载体pLV-3×Flag-mCherry（2A）Puro。干扰RNA（shRNA）包括用于SKI基因敲低的pLV-shRNA-EGFP（2A）Puro-SKI-#1、pLV-shRNA-EGFP（2A）Puro-SKI-#4和对照载体pLV-shRNA-EGFP（2A）-NC购自常州锐博生物公司。1.1.2主要试剂与仪器胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；Lipo6000 siRNA /DNA转染试剂与RIPA强效细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。兔源二抗和鼠源二抗购自武汉亚科因生物科技有限公司。实验所需的Transwell小室购自美国BD Biosciences公司；MonScriptTM RTⅢ All-in-One Mix试剂购自北京百奥曼技术有限公司。实验所需的Transwell小室购自美国BD Biosciences公司；SKI、母源性抗骨形态发生蛋白同源物（small mothers against decapentaplegic homolog， SMAD2）2、SMAD3、SMAD4、磷酸化SMAD（phosphorylated SMAD， p-SMAD）2、p-SMAD3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和FLAG标签抗体（DYKDDDDK epitope tag， FLAG）抗体（1∶1 000）购自美国Proteintech公司；实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司，型号：QuantStudio 3）；光学显微镜（美国COIC公司，型号：XDS-18型）；流式细胞仪（美国Thermo Fisher公司，型号：Attune CytPix）。1.2实验方法1.2.1构建SKI稳定异常表达和突变的胆管癌细胞系慢病毒包装质粒与目标质粒以1∶2∶3的比例共同转染至HEK293T细胞中。8 h后，换正常培养基培养。于转染后的24 h及48 h两个时间点收集上清液，并使用0.45 μm孔径的过滤器过滤细胞碎片。随后，加入6倍浓缩的病毒溶液，并低温超速离心处理30 min，富集病毒颗粒。3 d后，通过添加适量嘌呤霉素（浓度为2 mg/L）进行筛选，从而获取能够稳定表达目的基因的细胞群体。最终，从SKI mRNA表达水平和蛋白表达水平两个方面来验证SKI是否稳定异常表达及突变。1.2.2Western blot实验将含有10%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液与等量的蛋白上样缓冲液混合，6孔板每孔加入300 μL该混合液后，在冰浴条件下进行30 min的裂解。之后，通过沸水处理10 min以获取总蛋白样本，-20 ℃条件下保存。接着，在10%浓度的SDS-PAGE胶上点样并实施电泳及电转步骤。完成电泳后，使用脱脂乳封闭1 h，随后在4 ℃环境下用SKI、SMAD2、p-SMAD2、SMAD3、p-SMAD3、SMAD4、GAPDH及FLAG一抗（1∶2 000）孵育过夜，期间需经过3次洗涤。接下来，添加对应一抗的二抗（1∶2 500）继续孵育1 h，洗涤3次，并最终加入显影液进行显影。1.2.3免疫共沉淀（co-inmunoprecipitation，Co-IP）首先，使用细胞刮刀将培养皿底部的RBE和QBC939稳转株细胞刮下，并用含有10%蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）进行清洗。随后，在这些细胞中加入适量的裂解缓冲液（含有10%的蛋白酶抑制剂），并在冰上孵育30 min后，4 ℃条件下，14 000 r/min 离心15 min，分离得到上清液，并从中分出一小部分单独保存。剩余的上清液部分，则加入适量Protein A/G琼脂糖珠，并在4 ℃条件下过夜孵育。之后，用裂解缓冲液洗涤3次。接着，向IP和Input样品中分别加入适量的蛋白质上样缓冲液（同样包含10%的蛋白酶抑制剂），并置于沸水中加热10 min。最后，通过WB技术检测上述样品中的目标蛋白质。1.2.4实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）实验收集细胞沉淀后，用柱子法提取总的RNA，并分光光度法测量其浓度。接着，选取500 ng RNA样本，向其中加入2 μL MonScriptTM RTⅢ All-in-One Mix试剂，并使用无RNase水调整至最终体积为10 μL，以此来进行逆转录反应生成cDNA。随后，以cDNA作为模板进行qPCR实验，所用特异性引物靶向SKI基因，并以Actin作为内参照，所有样本均设3个重复。采用2-ΔΔCT方法计算其相对表达量，探究不同处理条件下SKI基因的表达变化。1.2.5CCK-8实验检测细胞活力收集细胞沉淀后进行重悬，将2 000个细胞接种到96孔板内，并设立3组平行实验。在细胞培养开始后的第1、2、3、4、5天，按CCK-8溶液和无血清培养基以1∶9的比例配置CCK-8混合液，向每个孔中加入100 μL的混合液，1.5 h后，在酶标仪450 nm波长下，振动5 s后，测定吸光度（Absorbance，A）值，绘制细胞生长曲线图。1.2.6细胞平板克隆实验检测细胞增殖重悬细胞沉淀，选取2 000个细胞铺板，每组设置3个重复。当观察到小皿底部形成肉眼可见的克隆时，即实验达到预期效果。使用4%多聚甲醛溶液在室温条件下固定样本30 min，清洗后使用0.5%结晶紫溶液在室温下染色30 min后，通过拍照记录结果，并用ImageJ软件对形成的细胞克隆数量进行统计分析。1.2.7Transwell法评估细胞侵袭能力首先，利用无血清培养基饥饿细胞24 h后，将5×104个细胞铺板于Transwell迁移小室内；与此同时，在小室外侧加入含有血清的培养基。培养24 h后，清洗小室内部。使用4%多聚甲醛固定细胞，并采用0.5%结晶紫溶液在室温下染色30 min后，清洗多余的结晶紫溶液。最后，通过倒置荧光显微镜随机选取多个视野拍摄细胞迁移和侵袭情况的照片，并统计迁移细胞的具体数量。1.2.8细胞伤口愈合实验评估细胞迁移侵袭能力重悬细胞沉淀，选取1.5×105个细胞铺板。当细胞覆盖率接近或达到90%时，在单层细胞上使用适当尺寸的移液管尖端制造一条直线型伤口。之后，PBS轻轻冲洗去除细胞碎片，继续培养。在制造伤口后的初始时刻（即0 h）及24 h后，通过光学显微镜随机选取并拍摄伤口区域的照片。运用ImageJ软件对比不同时间点下伤口愈合情况，量化细胞迁移效率。1.2.9EdU法检测细胞增殖重悬细胞沉淀，选取1.5×105个细胞铺板，培养12 h。之后，在每个孔中加入1 μL 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）工作液，继续孵育1.5 h。收集细胞，向其中添加无水甲醇，在室温条件下静置15 min固定细胞，随后使用PBS清洗2次。加入0.3%的免疫染色通透液，在室温下静置20 min。PBS清洗2次后，加入500 μL Click反应混合液，在避光且室温的环境下静置孵育30 min，再用PBS洗涤2次。加入2 μL Hoechst 33342活细胞染色液，在室温且避光条件下静置10 min，再次用PBS清洗2次。通过流式细胞仪分析来评估细胞增殖情况。1.2.10流式细胞术检测细胞周期重悬细胞沉淀，选取1.5×105个细胞铺板，培养24 h后，收集细胞，使用300 μL PBS重悬，接着将其缓慢滴入700 μL预冷的无水乙醇中，-20 ℃条件下固定过夜。完成固定步骤后，PBS清洗2次，在含有20 μg/mL核糖核酸酶A与40 μg/mL碘化丙啶的500 μL PBS溶液中重新悬浮细胞沉淀物，在室温且避光条件下静置15 min。最后，通过流式细胞仪来测定细胞周期分布情况。1.2.11流式细胞术检测细胞凋亡重悬细胞沉淀，选取1.5×105个细胞铺板，培养24 h后，在避光条件下向每个孔内添加1 μL H2O2溶液，并持续刺激24 h。收集细胞样本，用预冷的PBS缓冲液清洗，然后将细胞重悬于100 μL含有钙离子的缓冲液（即1×Binding Buffer）中。接着，向细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC与10 μL碘化丙啶，再次充分混合后，在室温且避光环境下孵育15 min。完成孵育后，再向样品中加入400 μL 含有钙离子的缓冲液。最后，通过流式细胞仪来测定胆管癌细胞的细胞凋亡状况。1.3临床相关性分析本研究从基因表达谱交互分析2（gene expression profiling interactive analysis2， GEPIA2）平台下载获得了来自TCGA和GTEx项目的31种癌组织及癌旁组织的RNA-seq表达数据，并比较了SKI基因在肿瘤样本与非肿瘤样本间表达水平的差异性。1.4统计学处理本文中所有统计分析和图表绘制均使用GraphPad Prism 9软件完成，且所有实验均独立重复3次。所有统计图（服从正态分布且样本量较小）均通过t检验进行统计分析对照组与实验组之间的差异，确定显著性，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SKI在胆管癌组织中高表达且在多种肿瘤中突变本研究分析了来自GEPIA2的数据资源，该平台整合了TCGA与GTEx两大项目的RNA测序信息，覆盖了31种癌症及其对应正常组织。基于此数据集，本研究对SKI在多种肿瘤中mRNA的表达水平进行了全面评估。结果显示，在CHOL病例中，相较于健康肝脏样本，SKI基因转录产物的丰度显著增加（图1A）。此外，SKI在食管癌、胶质母细胞瘤、脑低级别胶质瘤等11种肿瘤中的表达也显著高于癌旁组织（图1B）。Human Protein Atlas数据库的数据显示，在CHOL中SKI的蛋白水平也明显高于正常肝组织（图1C）。通过查询COSMIC数据库发现SKI在多种肿瘤中均发生突变，其中肝脏相关肿瘤SKI的突变发生率为3.12%（图1D）。在所有突变中，CT（35.12%）和GA（26.76%）在肿瘤中的突变最多（图1E）。综上所述，SKI在CHOL等多种肿瘤中均高表达，并且发生突变。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1SKI在肿瘤组织和正常组织中的表达水平Fig. 1Expression levels of SKI in tumor tissues and normal tissuesA： The expression of SKI in cholangio carcinoma tissuesand adjacent non-tumor nasobiliarytissues from TCGA-CHOL was analyzed using GEPIA database； B：The expression of SKI mRNA in the tumor tissues and adjacent non-tumor tissues of 31 types of cancer from TCGA in GEPIA platform； C： Representative immunohistochemical images of SKI in cholangio carcinoma and normal nasobiliary tissues （Human Protein Atlas Database） ×40； D，E： The mutation of SKI in COSMIC； ACC： Adrenocortical carcinoma； BLCA： Bladder urothelial carcinoma； BRCA： Breast invasive carcinoma； CESC： Cervical squamous cell carcinoma； CHOL： Cholangio carcinoma； COAD： Colon adenocarcinoma； DLBC： Diffuse large B-cell lymphoma； ESCA： Esophageal carcinoma； GBM： Glioblastoma multiforme； HNSC： Head and neck squamous cell carcinoma； KICH： Kidney chromophobe； KIRC： Kidney renal clear cell carcinoma； KIRP： Kidney renal papillary cell carcinoma； LAML： Acute myeloid leukemia； LGG： Brain lower grade glioma； LIHC： Liver hepatocellular carcinoma；LUAD： Lung adenocarcinoma； LUSC： Lung squamous cell carcinoma； OV： Ovarian serous cystadenocarcinoma； PAAD： Pancreatic adenocarcinoma； PCPG： Pheochromocytoma/paraganglioma； PRAD： Prostate adenocarcinoma； READ： Rectum adenocarcinoma； SARC： Sarcoma； SKCM： Skin cutaneous melanoma； STAD： Stomach adenocarcinoma； TGCT： Testicular germ cell tumors； THCA： Thyroid carcinoma； THYM： Thymoma； UCEC： Uterine corpus endometrial carcinoma； UCS： Uterine carcinosarcoma； *P0.05 vs Normal group.2.2SKI异常表达及突变稳定株的鉴定通过慢病毒包装，以获得SKI基因稳定异常表达及其突变的QBC939和RBE细胞系。从对照组（pLV-3×Flag）、过表达野生型及突变型SKI的实验组（pLV-SKI-WT与pLV-SKI-Mut 539C T）中分别提取了RNA和蛋白质，进行了qPCR分析和WB检测，来验证SKI的过表达及突变情况。结果显示，相较于空白对照组，SKI过表达组在mRNA和蛋白质表达水平显著提升（t蛋白=3.127、2.935，tmRNA=3.090、3.802，均P0.05）；SKI突变组mRNA和蛋白质表达水平高于SKI过表达（t蛋白=4.858、3.136，tmRNA=3.004、3.507，均P0.05）。同样地，也从阴性对照组（shNC）以及两个不同的SKI敲低组（shSKI-#1、shSKI-#4）中分离出相应的RNA和蛋白，并通过qPCR技术和WB检测SKI表达水平的变化。敲低SKI后，观察到了明显的下降趋势（t蛋白=3.996、7.803、2.898、3.401，tmRNA=3.444、3.082、2.911、3.253，均P0.05）。数据表明成功构建SKI稳定异常表达及突变的QBC939和RBE细胞株，见图2。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2QBC939和RBE细胞中SKI异常表达及突变效果的鉴定Fig. 2Identification of the effects of SKI abnormal expression and mutation in QBC939 and RBE cellsA： The protein levels of SKI in the overexpression， mutation and knockdown groups of QBC939 and RBE cells were detected by WB； B： The mRNA expression levels of SKI in the overexpression， mutation and knockdown groups of QBC939 and RBE cells were detected by qPCR； *P0.05 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01 vs shNC group.2.3SKI突变可显著促进胆管癌细胞的增殖能力CCK-8、EdU掺入法和细胞平板克隆实验结果表明，SKI基因过表达显著增强了QBC939和RBE两种细胞系的增殖活性（tCCK-8=2.900、2.966，tEdU=3.239、3.723，tcolony=4.714、4.839；均P0.05），且SKI基因突变表现出的促增殖效果强于SKI基因过表达组（tCCK-8=2.905、3.555，tEdU=3.721、5.294，tcolony=4.927、3.625；均P0.05）。相反，当SKI基因被敲低时，这两种细胞增殖能力的明显下降（tCCK-8=3.406、3.716、2.756、2.637，tEdU=2.952、3.865、3.194、6.691，tcolony=4.822、10.230、10.730、11.620；均P0.05），见图3。所以SKI基因过表达后显著促进胆管癌细胞系的增殖，而其突变后对胆管癌细胞系增殖的促进作用进一步增强；相反，SKI基因敲低后胆管癌细胞系的增殖能力显著降低。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3SKI异常表达及突变对胆管癌细胞的增殖能力的影响Fig. 3The impact of SKI abnormal expression and mutation on the proliferation ability of cholangiocarcinoma cellsA： The proliferation ability of the SKI overexpression， mutation and knockdown groups in QBC939 and RBE cells was detected by the CCK-8 assay； B： The proliferation ability of the SKI overexpression， mutation and knockdown groups in QBC939 and RBE cells was detected by the EdU assay； C： The proliferation ability of the SKI overexpression， mutation， and knockdown groups in QBC939 and RBE cells was detected by the cell colony formation assay ×40； *P0.05， **P0.01 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01， &&&P0.001 vs shNC group.2.4SKI突变可显著抑制胆管癌细胞的细胞凋亡Annexin V-APC/PI染色法结合流式细胞术检测实验结果显示，与对照组相比，SKI基因过表达显著抑制两种细胞的凋亡（t=4.645、3.765，均P0.05），且在SKI突变中这种抑制作用较SKI过表达组更明显（t=2.817、7.110，均P0.05）。见图4A。相反，当SKI敲低时，QBC939和RBE细胞的凋亡水平显著增加（t=4.487、5.897、3.712、7.518，均P0.05）。见图4B。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4SKI异常表达及突变对胆管癌细胞的凋亡能力的影响Fig. 4The impact of SKI abnormal expression and mutation on theapoptosisability of cholangiocarcinoma cellsA： The apoptosis ability of the SKI overexpression and mutation groups in QBC939 and RBE cells was analyzed by flow cytometry； B： The apoptosis ability of the SKI knockdown groups in QBC939 and RBE cells was analyzed by flow cytometry； *P0.05， **P0.01 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01 vs shNC group.2.5SKI突变可显著促进胆管癌细胞的细胞周期进程流式细胞术结果显示，与对照组相比，SKI过表达后，胆管癌细胞中G1阶段的细胞比例明显下降（t=15.240、2.892，均P0.05），同时S期细胞的比例显著上升（t=2.906、4.564，均P0.05）；且在SKI突变中G1期（t=8.669、2.772，均P0.05）和S期（t=4.145、3.548，均P0.01）细胞比例的变化较过表达组更大，但过表达组和突变组G2期变化差距都不显著（P0.05）。见图5A。相反，SKI敲低后，胆管癌细胞中G1期细胞的数量显著增加（t=3.241、13.760、3.728、4.335，均P0.05），S期的细胞数目减少（t=2.516、3.029、3.706、6.708，均P0.05），但RBE细胞G2期的细胞数量却增加了，可能是实验过程中细胞状态不好导致了细胞G2期比例上升（t=3.370、4.321，均P0.05），与预期相反。见图5B。以上结果提示，SKI过表达后显著促进胆管癌细胞的G1和S期进程，而突变后对G1和S期进程的促进作用进一步增强；SKI敲低后，胆管癌细胞的G1和S期进程显著减慢。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5SKI异常表达及突变对胆管癌细胞的细胞周期的影响Fig. 5The impact of SKI abnormal expression and mutation on the cell cycle of cholangiocarcinoma cellsA： The cell cycle of the SKI overexpression and mutation groups in QBC939 and RBE cells was analyzed by flow cytometry； B： The cell cycle of the SKI knockdown groups in QBC939 and RBE cells was analyzed by flow cytometry； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01， ###P0.001 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01， &&&P0.001 vs shNC group.2.6SKI突变可显著促进胆管癌细胞的迁移能力Transwell细胞迁移实验与细胞划痕实验结果显示，与对照相比，SKI基因过表达后胆管癌细胞系QBC939和RBE的迁移能力增加（tTranswell=4.724、7.99，tWound healing =3.041、3.219；均P0.05）；与过表达SKI相比，SKI突变后对胆管癌细胞迁移的促进作用更加显著（tTranswell=4.744、3.107，tWound healing=3.137、3.652；均P0.05）。见图6A、6C。相反，SKI敲低后，胆管癌细胞系的迁移能力降低（tTranswell=3.308、4.425、3.465、6.889，tWound healing =3.878、3.922、2.906、5.305；均P0.05）。见图6B、6D。综上所述，SKI促进胆管癌细胞的迁移，而SKI突变表现为一种功能获得性变异，在胆管癌细胞中发挥致癌作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F006图6SKI异常表达及突变对胆管癌细胞的细胞迁移侵袭的影响 ×40Fig. 6The impact of SKI abnormal expression and mutation on the migration of cholangiocarcinoma cells ×40A， C： The migration abilities of the SKI overexpression and mutation groups in QBC939 and RBE cells were detected by Transwell assay and wound healing assay； B， D： The migration abilities of the SKI knockdown groups in QBC939 and RBE cells were detected by Transwell assay and wound healing assay； *P0.05， **P0.01 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01 vs shNC group.2.7SKI突变通过抑制TGF-β/SMAD4信号通路发挥原癌基因的功能通过Western blot实验，本研究在QBC939与RBE细胞系中探讨了SKI基因异常表达及其突变对SMAD2、SMAD3、p-SMAD2、p-SMAD3以及SMAD4蛋白质水平的影响。结果显示，与对照组相比，SKI过表达、突变及敲低后，SMAD2、SMAD3、SMAD4的蛋白表达水平未检测到显著变化。与对照组相比，SKI基因过表达后QBC939与RBE细胞系p-SMAD2和p-SMAD3的表达水平降低（t=4.535、2.959、3.008、2.815，均P0.05）；与过表达SKI组相比，SKI突变后p-SMAD2和p-SMAD3表达水平的降低更加显著（t=5.515、3.548、3.252、4.122，均P0.05）。见图7A。相反，与对照组相比，SKI基因敲低后QBC939与RBE细胞系p-SMAD2和p-SMAD3的蛋白水平升高（t=3.692、4.155、3.244、7.775、2.891、3.616、2.782、5.126，均P0.05）。见图7B。为了检测SKI突变对SMAD4/p-SMAD2/p-SMAD3复合体形成的影响，进行Co-IP实验。结果显示（图7C），SKI不仅能与SMAD4发生相互作用，并且抑制了SMAD2、SMAD3的磷酸化（t=2.859、4.579、4.336，均P0.05），使SMAD4无法与p-SMAD2/3结合，抑制了具有转录活性的SMAD4/p-SMAD2/p-SMAD3复合体的形成，进而抑制了TGF-β/SMAD信号传导。提示SKI及其突变体可能通过阻断TGF-β/SMAD信号传导途径来促进胆管癌的发展过程。 10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F007图7SKI异常表达及突变对TGF-β/SMAD信号通路中相关蛋白表达的影响Fig. 7The impact of SKI abnormal expression and mutation on the expression of TGF-β/SMAD signaling pathway-related proteinsexpression and mutation on the protein levels of GAPDH， SMAD4， SMAD2， SMAD3 and their phosphorylation （p-SMAD2， p-SMAD3）， with densitometric analysis （GAPDH as loading control）； B： The effects of SKI knockdown on the protein levels of GAPDH， SMAD4， SMAD2， SMAD3 and their phosphorylation （p-SMAD2， p-SMAD3）， with densitometric analysis （GAPDH as loading control）； C： Co-Immunoprecipitation （Co-IP） assay was used to investigate the impact of SKI abnormal expression and mutation on the formation of the p-SMAD2/p-SMAD3/SMAD4 Complex； *P0.05 vs pLV-3×Flag group； #P0.05， ##P0.01 vs pLV-SKI-WT group； &P0.05， &&P0.01 vs shNC group. 3讨论CHOL至今仍是世界上最大的健康难题之一，其全球发病率和病死率高居不下。研究［7］表明，SKI作为原癌基因，与肿瘤的发生发展关系密切，其高表达于多种恶性肿瘤，如胰腺癌、肺癌、白血病、胃癌等。然而，关于SKI基因突变对癌症发展的影响，研究尚不充分，仍需进一步探索。因此，探究SKI基因表达异常及其突变与胆管癌细胞发生发展的关联性，并揭示其潜在的生物学功能及相关致病机制，对于改善CHOL早期诊断及治疗方案具有重要意义。通过查询COSMIC数据库发现SKI的突变广泛存在于多种肿瘤中，其中肝脏相关肿瘤SKI的突变发生率最高。在肿瘤样本中，CT和GA是最常见的突变类型。同时研究显示，在Shprintzen-Goldberg综合征中存在SKI的99C T和103C T两个重要的功能获得型突变［4］，在马方综合征中SKI的539C T是一个重要的功能获得型突变［5］。而在肿瘤中主要存在SKI的CT和GA的突变。前期对99C T、103C T和539C T三个突变在胆管癌中的作用进行了初步研究，结果显示SKI的539C T突变在胆管癌中是一种功能获得型突变［4–5］。后续对SKI的539C T突变在胆管癌中的功能和机制进行了详细的研究。本研究重点关注了SKI过表达、敲低及其突变对于胆管癌细胞发展过程中所起的生物学功能及其作用机制。实验结果表明，无论是SKI过表达还是突变，均显著增强了QBC939和RBE细胞的增殖和迁移能力，并且抑制了细胞凋亡；反之，敲低SKI后，则与上述结果相反。此外，相比于过表达SKI，SKI突变后，G1期细胞数量的下降和S期细胞数量的增加都更为明显；而SKI敲低后，抑制了QBC939和RBE细胞的增殖和迁移能力，促进了细胞凋亡，其G1期细胞比例上升，S期细胞比例相应地下降。以上实验数据提示，与SKI过表达相比，SKI基因突变在胆管癌细胞中的原癌基因功能发挥更为显著。SKI在调控多种与癌症进展紧密相关的细胞信号通路中扮演着重要角色，这些通路包括TGF-β信号途径、核激素受体信号、P21-P53信号机制、BMP信号传导路径、Hippo信号系统等［7］。其中SKI与TGF-β信号通路的相互作用机制是目前最受关注的领域［4–5， 8］。在多种肿瘤中（如前列腺癌、黑色素瘤、胶质瘤等），SKI可以通过抑制TGF-β信号通路促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移［9–11］。同时多项研究［12–13］证实，TGF-β信号通路通过调控细胞增殖、迁移及微环境重塑等关键过程，在胆管癌的病理进程中发挥着调节作用。一方面，酪氨酸激酶抑制剂Lenvatinib可以通过增加AZGP1基因启动子区 H3K27Ac 的乙酰化水平来增加 AZGP1 的表达，降低了磷酸化 SMAD3 的水平来抑制了TGF-β1/SMAD3 信号通路，从而抑制 CHOL细胞中的上皮-间充质转化，抑制了CHOL的增殖、迁移侵袭［14］。另一方面蛋白酪氨酸磷酸酶非受体3（PTPN3） 深度增强 TGF-β信号传导，促进TGF-β诱导的R-SMAD磷酸化、转录反应和随后的生理反应，抑制了CHOL的发生发展［15］。为了探究在胆管癌细胞发展过程中，SKI如何调控TGF-β信号通路来促进胆管癌细胞的增殖和迁移，本研究通过Co-IP实验验证SKI与SMAD因子之间的关系。结果显示，SKI与SMAD4之间存在相互作用，这种相互作用阻碍了p-SMAD2/p-SMAD3/SMAD4复合物的形成，进而抑制了TGF-β/SMAD信号通路相关蛋白质的功能，促进了胆管癌细胞的发展。综上所述，本研究初步验证了SKI过表达及突变后促进了胆管癌细胞的增殖及迁移，抑制其凋亡，促进了G1和S期进程，其中SKI突变后对胆管癌细胞生长的促进作用更强；而敲低SKI后，结果相反。此外，SKI可以通过与SMAD4相互作用，抑制SMAD2/3的磷酸化，抑制TGF-β/SMAD信号通路，从而发挥原癌基因的作用。本研究为胆管癌的诊疗提供了新的理论依据，可进一步探索其临床应用价值，以期带来更有效的治疗方案。