矽肺病是由长期吸入大量游离SiO2粉尘引起的一种职业性尘肺病［1］。2023年全国职业性尘肺病在各类职业病新病例中占比76.05%［2］。巨噬细胞是矽肺纤维化形成进程中的重要免疫细胞，尤其是肺泡巨噬细胞能够识别和吞噬吸入的SiO2颗粒，是启动肺部正常免疫功能和引起炎症反应的第一步［1］。非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2， PTPN2）通过磷酸酪氨酸的信号转导以调节多种细胞过程，其广泛的调节途径与炎症反应、免疫反应密切相关［3］。研究［4］显示炎症性疾病中伴发PTPN2的异常表达，且过表达Ptpn2后能够减轻大鼠神经炎症。而特异性敲除Ptpn2的小鼠表现出因炎症应激引起加速死亡，提示PTPN2可能具有抗炎作用［5］。在炎症性疾病模型研究中，PTPN2通过抑制巨噬细胞中炎症因子的释放发挥保护作用，可作为炎症性疾病的潜在治疗靶点［6］。课题组前期研究［7］表明PTPN2可通过去磷酸化STAT3抑制上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）减轻大鼠矽肺纤维化。然而，PTPN2是否通过调节巨噬细胞炎症发挥抗纤维化作用尚不清楚。因此，该研究拟通过体外实验观察过表达Ptpn2对于SiO2介导的肺泡巨噬细胞炎症反应的作用机制，以期为矽肺纤维化的干预和治疗提供实验依据。1材料与方法1.1主要材料与仪器小鼠肺泡巨噬细胞MH-S购自中国科学院细胞库；RPMI-1640培养基、SiO2粉尘（0.5~10.0 μm，纯度99%）（美国Sigma公司，货号：R5886、S5631）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司，货号：04-001-1ACS）；β-巯基乙醇、NOD 样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3， NLRP3）抗体、山羊抗鼠抗体、山羊抗兔抗体（中国瑞帕特公司，货号：RS1015、RA1075、S1001-100、S1002-100）；Ptpn2慢病毒包装试剂盒（中国合生基因科技有限公司合成）；嘌呤霉素（美国Cayman公司，货号：13884）；β-actin抗体（中国爱博泰克公司，货号：AC038）；PTPN2抗体、气孔形成蛋白D（gasdermin D， GSDMD）抗体（美国Affinity Biosciences公司，货号：DF6629、AF4012）；磷酸化核因子κB（phosphorylated nuclear factor kappa-B， p-NF-κB）抗体、核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）抗体、Toll样受体4（toll-like receptor 4， TLR4）抗体、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）抗体、转化生长因子-β受体1（transforming growth factor-β receptor 1， TGF-βR1）抗体、转化生长因子-β受体2（transforming growth factor-β receptor 2， TGF-βR2）抗体（中国Arigo公司，货号：ARG51518、ARG51013、ARG204679、ARG56429、ARG57752、ARG59501）；髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response 88， MyD88）抗体、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）抗体（美国Gene Tex公司，货号：GTX112987、GTX110520）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1（cysteine-aspartic acid protease 1， Caspase-1）抗体、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）抗体（美国Santa cruz公司，货号：sc-56036、sc-515598）；磷酸化母亲抗去头蛋白同源物 2/3（phosphorylated mothers against decapentaplegic homolog 2/3，p-Smad2/3）抗体、Smad2/3抗体（美国BD Biosciences公司，货号：552598、610842）；ECL超敏发光试剂盒（中国庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：25AF04）CO2培养箱、酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Forma 3111、Multiskan FC）；SDS-PAGE电泳仪和电转仪（美国Bio-Rad公司，型号：Mini-PROTEAN Tetra、Mini Trans-Blot Cell）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：ChemiScope 6100）。1.2实验方法1.2.1细胞分组与处理选用MH-S细胞，培养在含15%胎牛血清和0.1% β-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中，最终置于恒温37 ℃、5%体积分数的CO2细胞培养箱中培养。采用第3代细胞进行试验，于RPMI-1640空白培养基中同步化处理24 h后进行转染慢病毒处理。计算慢病毒和凝聚胺体积后将空白载体（1.83×108 TU）与Ptpn2过表达载体（1.83×108 TU）慢病毒分别转染细胞，转染48 h后使用含有嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，抗性筛选2周后得到稳转空载对照组和过表达Ptpn2组细胞系。将慢病毒转染成功的MH-S细胞进行SiO2诱导，共分为4组：空载对照组（NC组），空白培养基培养空白载体转染的细胞24 h；过表达Ptpn2组（P组），空白培养基培养Ptpn2过表达细胞24 h；空载对照+SiO2诱导组（NS组），空白培养基培养空白载体转染的细胞并给予终浓度100 μg/mL 的SiO2诱导24 h；过表达Ptpn2+SiO2诱导组（PS组），空白培养基培养Ptpn2过表达细胞并给予终浓度100 μg/mL 的SiO2诱导24 h。1.2.2蛋白质组学生物信息学分析将NC组、P组、NS组和PS组进行同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification， iTRAQ）技术联合液相色谱串联质谱（liquid chromatography-trandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技术筛选差异蛋白。细胞经转染慢病毒及SiO2诱导处理24 h后提取蛋白，经蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，确保样品间浓度一致，经同位素标记技术对不同样本进行标记，将标记后的肽段样品进行液相色谱分离，通过液相色谱-质谱联用进行定量和定性分析。将得到的质谱数据去除噪音信号和背景信号后计算差异倍数和显著性水平，根据差异倍数以及显著性水平进行差异蛋白筛选，并绘制维恩图和聚类热图，进一步对筛选得到的差异蛋白进行基因本体（gene ontology， GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析。1.2.3Western blot采用总蛋白提取法提取细胞蛋白，每皿细胞加入200 μL总蛋白裂解液，4 ℃裂解20 min后转移进1.5 mL EP管置于4 ℃离心机，以12 000 r/min条件下离心30 min，提取上清液并进行BCA浓度测定，以每孔20 μg的蛋白质量进行常规电泳和电转。一抗PTPN2、p-NF-κB、NF-κB、MyD88、TLR4、TNF-α、NLRP3、GSDMD、Caspas-1、IL-1β、TGF-β R1、TGF-β R2、p-Smad2/3、Smad2/3和β-actin稀释比均为1∶1 000，4 ℃孵育过夜；山羊抗兔或鼠抗体（1∶5 000）置于37 ℃摇床孵育30 min，ECL超敏发光试剂盒显色。采用Image-Pro-plus 6.0图像处理软件对条带进行灰度值分析，用目标蛋白与内参蛋白的比值进行蛋白相对表达量的分析。1.2.4细胞免疫荧光将MH-S细胞均匀铺至玻璃爬片，经4%多聚甲醛固定30 min，置于自来水中水化，然后分别置于梯度乙醇和二甲苯中，脱去胶圈，再经二甲苯和梯度乙醇处理，最后置于自来水中水化，置于含枸橼酸钠的修复盒中，高压修复80 s，PBS冲洗后孵育一抗TNF-α、GSDMD和TGF-β1，稀释比均为1∶500，于4 ℃冰箱过夜，次日于37 ℃温箱孵育异硫氰酸荧光素标记的二抗（1∶100）90 min，经DAPI封片后置于荧光显微镜下观察，拍摄图片。1.3统计学处理所有实验均重复3次，采用SPSS 23.0统计分析软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示；多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，事后两两比较方差齐采用 LSD-t 检验，方差不齐采用 Tamhane’s 检验，所有检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。2结果2.1过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中PTPN2蛋白表达水平的影响Western blot结果显示，与NC组比较，P组中PTPN2的蛋白表达水平上调（LSD-t=15.876， P0.05），而NS组中PTPN2的蛋白表达水平下调（LSD-t=-5.937， P0.05）；与NS组比较，PS组中PTPN2的蛋白表达水平上调（LSD-t=7.487， P0.05）。见图1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中PTPN2蛋白表达水平的影响Fig. 1The effects of the overexpression of Ptpn2 on the expression level of PTPN2 protein in MH-S cells induced by SiO2*P 0.05 vs NC group； #P 0.05 vs NS group.2.2蛋白质组生物信息学分析过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞的影响维恩图结果显示，在P0.05的条件下，筛选NS：NC组FC1.2同时满足PS：NS组FC0.83的差异表达蛋白以及NS：NC组FC0.83同时满足PS：NS组FC1.2的差异表达蛋白，共得到差异表达蛋白144个。见图2A。为直观展示各组间差异表达蛋白，对筛选得到的144个差异表达蛋白进行聚类分析得到可视化热图，热图颜色梯度代表蛋白表达水平，红色为上调，蓝色为下调，聚类结果显示4组蛋白表达谱差异显著且分组特异性强。见图2B。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2蛋白质组生物信息学分析差异蛋白韦恩图（A）与聚类热图（B）Fig. 2Venn diagram （A） and clustering heatmap （B） of differentially expressed proteins from bioinformatics analysis of the proteome对上述差异表达蛋白进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示，差异表达蛋白在生物学过程中主要富集在IκB激酶/核因子κB信号传导通路、免疫反应的细胞激活和信号转导及转录激活因子（STAT）介导的受体信号调控通路等；在分子功能中主要富集在泛素蛋白连接酶结合作用、泛素样蛋白连接酶结合作用和ω肽酶活性等；在细胞组分中主要富集在网格蛋白包被小窝、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物和蛋白激酶复合物等。见图3A-3C。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3蛋白质组生物信息学分析过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞的影响Fig. 3Proteomic bioinformatics analysis of the effects of the overexpression of Ptpn2 on MH-S cells induced by SiO2A-C： GO enrichment analysis； D： KEGG enrichment analysis； BP： biological process； CC： cellular component； MF： molecular function.KEGG分析结果重点关注炎症相关信号通路，结果显示差异蛋白主要富集在Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、TGF-β信号通路、TNF信号通路。见图3D。2.3过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中TLR4-TNF-α信号通路蛋白表达水平的影响免疫荧光染色结果显示，与NC组比较，NS组中TNF-α的表达增多；与NS组比较，PS组中TNF-α的表达减少。见图4。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4MH-S细胞爬片TNF-α免疫荧光染色图 ×200Fig. 4Immunofluorescence staining of TNF-α of MH-S cell climbing slices ×200Western blot结果显示，与NC组比较，NS组中p-NF-κB、MyD88、TLR4、TNF-α的蛋白表达水平显著上调（LSD-t=7.606、10.615、14.169、5.544，均P0.05）；与NS组比较，PS组中p-NF-κB、MyD88、TLR4、TNF-α的蛋白表达水平下调（LSD-t=-4.871、-10.244、-33.922、-9.279， 均P0.05）。与NC组比较，P组中p-NF-κB、MyD88、TLR4、TNF-α的蛋白表达水平差异无统计学意义（LSD-t=-0.024、0.725、2.538、-0.510，均P0.05）。见图5。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中TLR4-TNF-α信号通路蛋白表达水平的影响Fig. 5The effects of the overexpression of Ptpn2 on the expression levels of proteins in the TLR4-TNF-α signaling pathway in MH-S cells induced by SiO2*P 0.05 vs NC group； #P 0.05 vs NS group.2.4过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中NLRP3信号通路蛋白表达水平的影响免疫荧光染色结果显示，与NC组比较，NS组中GSDMD的表达增多；与NS组相比较，PS组中GSDMD的表达减少。见图6。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F006图6MH-S细胞爬片GSDMD免疫荧光染色图 ×200Fig. 6Immunofluorescence staining of GSDMD of MH-S cell climbing slices ×200Western blot结果显示，与NC组比较，NS组中NLRP3、GSDMD、Caspas-1、IL-1β的蛋白表达水平上调（LSD-t=13.638、6.761、20.185、8.785，均P0.05）；与NS组比较，PS组中NLRP3、GSDMD、Caspas-1、IL-1β的蛋白表达水平下调（LSD-t=-9.363、-4.924、-9.070、-10.586，均P0.05）。与NC组比较，P组中NLRP3、GSDMD、Caspas-1、IL-1β的蛋白表达水平无显著差异（LSD-t=2.437、-1.374、1.522、1.731，均P0.05）。见图7。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F007图7过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中NLRP3信号通路蛋白表达水平的影响Fig. 7The effects of the overexpression of Ptpn2 on the expression levels of proteins in the NLRP3 signaling pathway in MH-S cells induced by SiO2*P 0.05 vs NC group； #P 0.05 vs NS group.2.5过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中TGF-β1信号通路蛋白表达水平的影响免疫荧光染色结果显示，与NC组比较，NS组中TGF-β1的表达增多；与NS组比较，PS组中TGF-β1的表达减少。见图8。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F008图8MH-S细胞爬片TGF-β1免疫荧光染色图 ×200Fig. 8Immunofluorescence staining of TGF-β1 of MH-S cell climbing slices ×200Western blot结果显示，与NC组比较，NS组中TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2/3的蛋白表达水平上调（LSD-t=3.111、7.583、44.552，均P0.05）；与NS组比较，PS组中TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2/3的蛋白表达水平下调（LSD-t=-7.111、-6.705、-29.574，均P0.05）。与NC组比较，P组中TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2/3的蛋白表达水平无显著差异（LSD-t=-1.011、-0.671、-2.085， 均P0.05）。见图9。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F009图9过表达Ptpn2对SiO2诱导的MH-S细胞中TGF-β1信号通路蛋白表达水平的影响Fig. 9The effects of the overexpression of Ptpn2 on the expression levels of proteins in the TGF-β1 signaling pathway in MH-S cells induced by SiO2*P 0.05 vs NC group； #P 0.05 vs NS group.3讨论矽肺是中国危害最严重的职业病之一［2］。发生在多种工作场所，例如采矿、冶金、汽车制造业和研磨玻璃、瓷器等传统行业。目前对于矽肺纤维化的治疗缺乏有效的手段和靶向药物。因此，探索矽肺病的发病机制和寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。矽肺病发病机制复杂，研究［8–9］多认为巨噬细胞吞噬SiO2粉尘释放多种细胞因子，是矽肺纤维化发生、发展的首要环节。在矽肺纤维化形成过程中，肺泡巨噬细胞能够识别并吞噬可吸入的SiO2粉尘，经过一系列反应发生自身死亡，死亡的肺泡巨噬细胞会释放一系列促炎症因子，增加肺部炎症反应［8］。PTPN2作为炎症和免疫反应的重要调节因子，具有调节炎症反应的作用。PTPN2影响炎症免疫细胞内的功能，并通过多种信号通路调节促炎症因子的释放，以调节炎症反应的发生、进展和消退［3］。TLR信号通路的激活是巨噬细胞启动炎症反应的核心机制，能够促进炎症因子释放，加剧炎症反应［10］。TLR4通过MyD88依赖性通路激活NF-κB等转录因子，并释放TNF-α等促炎因子，在炎症反应中发挥关键作用［10］。PTPN2作为一种在所有细胞类型中均有表达的蛋白酪氨酸磷酸酶，能够直接作用于TLR下游接头蛋白MyD88的关键酪氨酸位点，使其去磷酸化进而阻断MyD88与TRAF6的结合，抑制NF-κB和MAPK通路的激活［11］。NLRP3/Caspase-1信号通路可通过调控促炎细胞因子IL-1β等的活性引发炎症反应，影响许多疾病的发生和进展［12］。Caspase-1作为NLRP3炎症小体的关键下游效应分子，激活后可增强IL-1β和IL-18的活性进一步加重炎症反应［13］。此外，NLRP3介导炎症小体复合物的组装并通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和NF-κB信号通路进一步介导MyD88激活［14］。同时，TNF-α和IL-1β又可以协同激活NF-κB，进一步募集炎症细胞［15］。PTPN2可通过去磷酸化c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK），抑制甾醇调控元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding Protein， SREBP）2的成熟，进而调节细胞凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ASC）4的磷酸化，调节NLRP3炎性小体的激活［16］。TGF-β信号通路的过度激活导致肺部细胞外基质的过度沉积，是肺纤维化形成的重要机制［17］。p-Smad2/3作为信号传导的关键节点，可进入细胞核调控相关基因表达，从而促进细胞外基质的合成与沉积，导致肺组织纤维化［18］。另外，TGF-β通过激活NF-κB引发信号传导，诱导NLRP3炎症小体激活，并增加促炎细胞因子IL-1β的分泌［19］。PTPN2能通过与Smad4结合，并在Tyr95位置去磷酸化，以保留Smad4的DNA结合能力，进一步调控TGF-β信号传导［20］，从而调节炎症反应。以上研究提示PTPN2可以通过调控以上信号通路，调控巨噬细胞炎症反应。本研究结果也证实，SiO2能够通过TLR4-TNF-α信号、NLRP3信号和TGF-β1信号的异常激活，引发巨噬细胞炎症反应，过表达Ptpn2可抑制SiO2介导的巨噬细胞TLR信号通路、NLRP3信号通路和TGF-β1信号通路的激活，抑制巨噬细胞炎症反应，进而调控矽肺纤维化进程。综上所述，过表达Ptpn2能够抑制SiO2介导的巨噬细胞炎症相关TLR4-TNF-α信号、NLRP3信号和TGF-β1信号，进而发挥对矽肺纤维化的保护作用，为矽肺纤维化的靶向调控提供潜在靶点信息和实验证据。然而，本研究并未进一步探讨以上信号通路的协同作用，未来的研究将聚焦于靶向Ptpn2基因调控矽肺纤维化炎症反应的深层作用机制，并深入分析这些信号通路间的协同调控网络。