非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。研究［1］表明，生活习惯、环境污染物、遗传和表观遗传等均可能是NAFLD的发病因素。砷是一种已知的环境污染物，在自然界中广泛存在，主要通过饮食和饮水进入人体［2］。目前，地下水砷污染已成为全球性公共卫生问题［3］。研究证实环境砷暴露导致脂质代谢紊乱［4］。然而，孕期砷暴露导致子代肝脏脂质代谢异常的机制尚未完全阐明。α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循环的重要中间代谢产物［5］，是谷氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的合成前体，在多种代谢过程中发挥着重要作用。有研究［6］表明，α-KG能预防高脂饮食引起的肝脏脂质代谢紊乱的发生。为此，本文拟探究α-KG对孕期母体砷暴露导致子代肝脏脂质代谢紊乱的保护作用及其机制，为生命早期砷暴露所导致的NAFLD的防治提供新的理论依据。1材料与方法1.1主要试剂亚砷酸钠（货号：S7400）和α-KG（货号：75890）购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；TRIzol试剂（货号：15596026）购自上海赛默飞世尔科技公司；油红O染液（货号：D027-1-3）购自南京建成生物工程研究所；色谱级甲醇（货号：34860-1L-R）、色谱级乙腈（货号：34851-1L）和色谱级异丙醇（货号：34863-2.5L）购自德国默克公司。1.2主要仪器三重四级杆串联质谱系统（美国AB Scientific Export公司，型号：Triple QuadTM 4500）；高效液相色谱仪（美国Agilent公司，型号：Agilent 1200）；高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司，型号：5427R）；生物样本均质仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Bioprep-24R）；超纯水仪（美国颇尔公司，型号：Cascada TMI）；多功能荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：BX53+DP80+Cellsens）；荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司，型号：LightCycler®480）。1.3动物分组及处理健康SPF级8周龄癌症所研究（institute for cancer research， ICR）小鼠购自北京维通利华公司。雌鼠体质量28~30 g，共32只，雄鼠体质量36~38 g，共16只。环境湿度（50±5）%，温度20~25 °C，每日12 h光照/黑暗循环，自由进食和饮水。适应性喂养1周后，雌雄按照2∶1比例进行合笼，次日早晨7点检查阴栓，阴栓阳性者记为GD0。将ICR孕鼠随机分为4组：对照组、砷组、α-KG组、砷+α-KG组，每组8只。在GD0~GD16，砷组和砷+α-KG组每天饮水暴露NaAsO2（15 mg/L），α-KG组和砷+α-KG组每天使用α-KG（2 g/kg）进行灌胃。在GD16天时，检测胎鼠体质量和顶臀长，并收集胎鼠肝脏。1.4转录组学分析对照组和砷组每组4个肝脏组织样品交由上海天昊生物科技有限公司提取总RNA并进行转录组学分析。利用Agilent 2100生物分析仪检测RNA质量，取适量总RNA，根据poly（A）结构分选、片段化mRNA，结合引物和逆转录酶合成第一链cDNA，以第一链为模板合成第二链。随后双链cDNA进行末端修复和3'末端加“A”反应，连接测序接头，PCR扩增DNA文库，使用Qubit和Agilent 2100 Bioanalyzer 分别检测文库浓度与文库片段长度，上机测序获得FASTQ数据。以Log Fold Change≥1.5，P0.05为标准进行差异基因筛选，并进行KEGG功能富集分析。1.5总三酰甘油水平及其亚型的检测每个样品称取20 mg胎肝组织，加入100 μL生理盐水进行匀浆，取50 μL匀浆液加入250 μL有机溶剂（丁醇∶甲醇=1∶1，含有10 mmol/L甲酸铵），涡旋3 min后超声1 h，室温下14 000 r/min离心10 min，重复2次后吸取100 μL上清液于进样瓶中，采用LC-MS/MS分析总三酰甘油及其亚型的水平。1.6油红O染色将胎肝组织置于OCT包埋剂中进行包埋，使用冰冻切片机切成10 µm 组织切片，黏附于载玻片上，配制油红O工作液进行染色，染色结束后进行封片，在光学显微镜下观察组织病理结果。1.7实时荧光定量PCR（qPCR）称取20 mg胎肝组织，加入1 mL TRIzol试剂进行匀浆，随后加入100 μL 1-溴-3-氯丙烷进行萃取，4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，取上清液加入4倍体积异丙醇析出RNA，使用预冷的75%乙醇进行洗涤。将RNA浓度定量在500 ng/μL，逆转录成cDNA后进行扩增反应。本实验中所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，实验合成引物序列如表1所示。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1PCR引物序列Tab.1Sequences of primers for PCRGeneForward sequence （5'-3'）Reverse sequence （5'-3'）18SGTAACCCGTTGAACCCCATTCCATCCAATCGGTAGTAGCGAcacaTTCACTGTGGCTTCTCCAGCGACCACCGACGGATAGATCGAcacbCCGCTCACCAACAGTAAGGTATGAGCTTGGCAGGGAGTTCAclCCTTCCCCGGTGAAAGAGTGGGGCTCAGGCTTTCTGTAGACScd1CGGTCATCCCATCGCCTGCTCTGTAGGCGAGTGGCGGAACTGCFasnCGCTCGGCTCGATGGCTCAGCCAGCACCACGGCATGCTCASrebf1CAGACTCACTGCTGCTGACAGATGGTCCCTCCACTCACCAPparαAGTGCAGCCTCAGCCAAGTTGAAAGGCAGGCCACAGAGCGCTAAGCpt1αTTCCAGACGTCTCTGCCGCGGGGCCAGTGCTGTCATGCGTHslGGAGCTCCAGTCGGAAGAGGGTCTTCTGCGAGTGTCACCAAtglACAGGGCTACAGAGATGGACTAGGCTGCAATTGATCCTCCTCMttpAAGAGGAGGAGCCTGTAGGGAGGCCTGTGGGTAGAAATGCPi3kACACCACGGTTTGGACTATGGGGCTACAGTAGTGGGCTTGGAktATGAACGACGTAGCCATTGTGTTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT1.8统计学处理本研究所有数据结果均采用均数±标准差表示。采用 SPSS 23.0 软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析 （One-way ANOVA）进行数据分析，采用Tukey检验进一步两两比较。PTuKey 0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1孕期砷暴露引起胎肝转录组变化图1A结果显示，与对照组相比，砷暴露组胎鼠肝脏基因组表达显著改变；火山图结果显示，孕期砷暴露后有2 144个基因下调，1 675个基因上调（图1B）。KEGG功能富集分析结果显示，差异基因在不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、PI3K/AKT信号通路中显著富集（图1C）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1胎肝转录组学Fig.1Transcriptomics analysis of fetal liversA： Heatmap of gene expression in fetal liver transcriptomes of the control and arsenic group； B： Volcano plot of gene expression in fetal liver of the control group and arsenic group； C： KEGG pathway analysis of gene expression in fetal liver of the control group and arsenic group.2.2α-KG改善孕期砷暴露诱导的胎鼠肝脏脂质沉积与对照组相比，砷组胎鼠体质量下降（PTuKey0.05），α-KG补充后体质量上升（PTuKey0.05）（表2）。与对照组相比，砷暴露组胎鼠顶臀长下降（PTuKey0.01），α-KG补充后顶臀长上升（PTuKey0.01）（表2）。油红O染色结果显示，与对照组相比，砷组肝脏脂滴明显增加，砷+α-KG组脂滴明显减少（图2A）；定量分析结果显示，与对照组相比，砷组脂滴阳性脂滴面积显著增加（PTuKey0.01），而α-KG补充后砷+α-KG组脂滴阳性区域面积明显减少（PTuKey0.01）（图2B）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T002表2胎鼠的生长发育指标（n=8，x¯±s）Tab.2Growth and development indexes of fetus（n=8，x¯±s）VariableCtrlAsα⁃KGAs+α⁃KGF valueP valueBody weight （g）0.76±0.010.70±0.02*0.75±0.040.74±0.01#7.2050.002Crown⁃rump length （mm）19.12±0.6817.77±0.51**19.03±0.3918.86±0.49##8.5100.001*P0.05， **P0.01 vs Ctrl group； #P0.05， ##P0.01 vs As group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2α-KG改善孕期砷暴露诱导的胎鼠肝脏脂质沉积Fig.2α-KG alleviated gestational arsenic exposure-evoked hepatic lipid deposition in fetusA： Oil red O staining of the liver tissues in fetus ×400； B： Quantitative analysis of oil red O staining；a： Ctrl group； b： As group； c： α-KG group； d： AS+α-KG group； **PTuKey0.01 vs Ctrl group； ##PTuKey0.01 vs As group.2.3α-KG减轻孕期砷暴露导致的胎鼠三酰甘油水平增加采用LC-MS/MS技术检测胎肝三酰甘油水平，图3A热图代表了不同组之间三酰甘油42种脂质亚型水平，包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。图3B代表了总三酰甘油水平。结果显示，与对照组相比，砷暴露组胎肝内三酰甘油水平升高（PTuKey0.05），α-KG补充后降低了肝脏内三酰甘油水平（PTuKey0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3胎肝内三酰甘油水平变化Fig.3The level of total triglyceride in fetal liversA： The heatmap of triglyceride； B： The level of total triglyceride； TGs： Total triglycerides； * PTuKey0.05 vs Ctrl group； # PTuKey0.05 vs As group.2.4α-KG减轻孕期砷暴露导致的胎鼠肝脏脂质代谢紊乱图4A结果显示肝脏脂质代谢相关基因表达的热图，包括肝脏脂质合成相关基因，如乙酰辅酶A羧化酶α（Acaca）、乙酰辅酶A羧基酶β（Acacb）、ATP枸橼酸裂解酶（Acl）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Scd1）、脂肪酸合酶（Fasn）和固醇调节元件结合转录因子1（Srebf1）；β-氧化相关基因，如过氧化物酶体增殖物激活受体α（Pparα）和肉碱棕榈酰基转移酶1α（Cpt1α）；肝脏脂质降解相关基因，如激素敏感脂肪酶（Hsl）和脂肪三酰甘油脂肪酶（Atgl）；以及脂质转运相关基因，微粒体三酰甘油转移蛋白（Mttp）。图4B基因表达定量结果显示，与对照组相比，脂质合成相关基因Acl、Fasn、Srebf1表达上调（PTuKey0.05），β-氧化相关基因Pparα，以及脂质降解相关基因Hsl和Atgl表达下降（PTuKey0.05），α-KG补充后逆转了Acl、Fasn、Pparα、Hsl、Atgl基因表达（PTuKey0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4胎肝脂质代谢相关基因表达水平Fig.4The expression level of lipid metabolism-related genes in fetal liversA： The heatmap of lipid metabolism-specific genes in fetal liver； B： The mRNA expression level of metabolism-specific genes in fetal liver； * PTuKey0.05 vs Ctrl group； # PTuKey0.05， ## PTuKey0.01 vs As group.2.5α-KG缓解孕期母体砷暴露对胎肝PI3K/AKT信号通路的抑制作用qPCR结果显示（图5），与对照组相比，砷暴露后PI3k和AKT mRNA表达水平均下降（PTuKey 0.05），相较于砷暴露组，砷+α-KG组PI3K和AKT mRNA表达水平显著上调（PTuKey 0.05），提示补充α-KG减轻孕期母体砷暴露对胎鼠肝脏内PI3K/AKT信号通路的抑制。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5胎鼠肝脏PI3K/AKT信号表达水平Fig.5The expression level of PI3K/AKT signaling in fetal livers* PTuKey0.05， ** PTuKey0.01 vs Ctrl group； #PTuKey0.05 vs As group.3讨论砷是广泛存在的环境污染物和致癌物质，已有多个国家均报道了地下水砷污染，远超世界卫生组织（WHO）规定的饮水中砷浓度的安全阈值［7］。本研究观察到，孕期砷暴露后降低胎鼠体质量和顶臀长，与既往报道的母体砷暴露导致胎盘发育不良和胎鼠生长受限一致［8–9］。砷还可能通过氧化应激和炎症诱导肝脏脂质沉积［10］，增加子代代谢性疾病的风险。本研究发现，孕期砷暴露导致胎鼠肝脏脂肪酸代谢基因异常表达，组织病理学和LC-MS/MS显示，胎鼠肝脏脂滴及三酰甘油水平显著升高，提示孕期砷暴露后导致子代肝脏发生脂质沉积，与前期研究［11］结果一致，证实了孕期砷暴露对子代肝脏脂代谢的负面影响。α-KG作为三羧酸循环的关键中间体，参与能量代谢、氧化应激调控和表观遗传修饰［12］。研究［13］表明，SLC7A11通过降低自由基水平促进α-KG/脯氨基羟化酶（PHD）活性，可减轻NAFLD的发展。另一研究［14］表明，α-KG补充减少小鼠体质量增加，降低血清胆固醇水平，改善了脂质沉积。本研究发现，孕期补充α-KG显著降低子代肝脏三酰甘油水平和脂滴的积累，提示α-KG对孕期母体砷暴露导致子代肝脏脂质沉积的保护作用。机制上，α-KG补充逆转了砷诱导的脂代谢基因紊乱（如上调Acl、Fasn、Srebf1，下调Hsl、Atgl），恢复了脂质代谢稳态。PI3K/AKT信号通路在信号转导和细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成等生物过程的调节中起重要作用［15］。本研究转录组分析显示，孕期砷暴露后子代肝脏中PI3K/AKT通路显著富集，且 PI3K和AKT mRNA表达水平显著下降，而α-KG补充后逆转这一趋势。这与既往研究一致，如龙胆苦苷通过靶向脂肪质素受体3（PAQR3）激活 PI3K/AKT 信号通路［16］，核孔蛋白85（NUP85）通过调节PI3K/AKT信号通路，减轻脂质沉积［17］。 此外，姜黄素和白藜芦醇通过 PPI3K/AKT/mTOR 和缺氧诱导因子1/血管内皮生长因子（HIF⁃1/VEGF）级联反应减轻代谢性相关脂肪肝疾病的肝脏脂肪变性［18］。这表明α-KG可通过PI3K/AKT信号通路调控下游脂代谢靶点，从而改善砷诱导的肝脏脂质沉积。本研究仍存在一定的局限性。首先，尽管本研究证实了补充α-KG对母体砷暴露所致子代肝脏脂质沉积的保护作用，但未能完全排除内源性α-KG代谢途径的潜在影响。其次，虽然本研究结果表明PI3K/AKT信号通路在砷诱导的肝脏脂质沉积中发挥关键作用，但这一结论仍需通过更直接的基因敲除实验来进一步验证。此外，本研究主要聚焦于α-KG的保护效应及其分子机制，尚未全面探讨其他可能的调控途径。未来研究可考虑通过代谢组学分析全面评估α-KG补充对子代肝脏整体代谢网络的影响，在不同发育阶段追踪α-KG干预的长期效应。这些深入研究将有助于更全面地理解α-KG在砷致发育毒性中的保护机制。综上所述，孕期补充α-KG可显著缓解砷暴露导致的子代肝脏脂质沉积，这一保护作用主要通过调控PI3K/AKT通路、恢复肝脏脂代谢稳态来实现。α-KG通过激活PI3K/AKT信号通路，逆转砷暴露导致的脂代谢相关基因表达紊乱，包括下调脂质合成关键基因的表达，同时上调脂质相关基因的表达水平。从组织病理学角度来看，α-KG干预可明显减少肝细胞内脂滴的积聚，降低肝脏三酰甘油含量。这些发现不仅阐明了α-KG通过PI3K/AKT通路改善脂代谢紊乱的分子机制，更重要的是为环境污染物导致的子代代谢性疾病的早期预防和干预提供了新的策略。