肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏疾病发展过程中一个关键且复杂的病理阶段，尽管早期HF是可逆的［1］，但目前仍未发现明确且有效的治疗方案［2］，因此，深入阐释HF的发病机制，对该病症的治疗尤为重要［3］。HF的特征是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖和迁移以及随后的胶原沉积［4］，作为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要生产者，其活化对于HF起着至关重要的作用［5］。矮小相关转录因子3（runt-related transcription factor 3，RUNX3）是一个重要的转录因子，能够激活或抑制靶基因转录，与多种类型肿瘤紧密关联。作为转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信号通路的下游效应因子，与Wnt信号通路存在交叉，同时，RUNX3在不同生理或病理情境中，往往表现出具有显著差异的多面性角色，在部分情境下其特定作用机制可促进肿瘤的发生发展［6］。有研究指出，RUNX3在胰腺癌［7］、支气管哮喘［8］、胶质瘤［9］、人类乳腺癌［10］等疾病中发挥调节作用。另有研究［11］表明，RUNX3在HF的防治中发挥潜在作用。该研究旨在探讨RUNX3对HSCs活化、增殖和迁移的影响，为HF治疗提供新的理论依据。1材料与方法1.1细胞株小鼠肝星状细胞系（JS-1）购自湖南丰晖生物科技有限公司。1.2试剂DMEM/F-12培养基、TRIzol试剂（货号：11039021、15596018）购自美国赛默飞世尔有限公司；胎牛血清（美国Gibco公司，货号：10099-141）；PBS试剂、Transwell小室（货号：21-031-CM、3470）购自美国Corning公司；胰蛋白酶、PMSF蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA试剂盒、Western blot试剂盒、EdU试剂盒（货号：C0203-500ml、ST2573-25g、P0045-100ml、P0010S、P0002、C0071S/C0071L）购自上海碧云天公司；逆转录、RT-qPCR试剂盒（货号：AG11707、AG11701）购自湖南艾克瑞生物公司；GAPDH一抗（货号：AF7021）购自Affinity公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗、I型胶原（Collagen I）一抗、RUNX3一抗、增殖标志物Ki-67（marker of proliferation Ki-67，Ki-67）（货号：55135-1-AP、14695-1-AP、27099-1-AP、27309-1-AP）购自武汉Proteintech公司；鼠源、兔源二抗（货号：ab150113、ab150064）购自美国Abcam公司，由上海生工公司合成RT-qPCR引物（表1），si-RUNX3由苏州吉玛基因股份有限公司合成，序列为S：5′-GCAACGCUUCCGCUGUCAUTT-3′；AS：5′-AUG ACAGCGGAAGCGUUG CTT-3′。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表 1引物序列Tab.1Primer sequencesGenePrimer sequence （5′⁃3′）RUNX3F： TTGATTCTCTAGGATCCGGGCR： TCGAAGGTCGTTGAACCTGGCollagen ΙF： CGATGGATTCCCGTTCGAGTR： CGATCTCGTTGGATCCCTGGα⁃SMAF： GGCATCCACGAAACCACCTAR： GTATGCGTGTGACGGCTCTAGAPDHF： CTGGAGAAACCTGCCAAGTATGR： GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT1.3仪器和设备细胞培养超净工作台（型号：SW-CJ-1B）购自苏州净化有限公司；倒置荧光显微镜（型号：IX71）购自日本Olympus Corporation公司；CO2培养箱（型号：HCP-80）购自上海海尔公司；凝胶成像仪（型号：G：BOX-CHEMI HR）购自英国Syngene公司；实时荧光定量PCR仪（型号：CFXMaestrol）购自美国Bio-RAD公司；酶标仪（型号：VarioskanLUX）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；低温离心机（型号：Centrifuge 5430 R）购自德国Eppendorf公司；高压灭菌锅（型号：YXQ-LS-50SII）购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；摇床（型号：M-Blot H4000）购自南京中科通仪科技有限公司；分光光度仪（型号：NanoPhotometer® N120）购自德国 Implen公司。1.4方法1.4.1HSCs培养细胞均在37 ℃、5% CO2培养箱中，在含有10%FBS和青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM/F-12）中培养，培养至铺满瓶底，细胞培养至90%汇合时使用胰蛋白酶消化后进行传代，并进行后续实验研究。1.4.2实验分组于6孔板中接种处于对数期生长的HSCs，实验分为对照组（Control组）和实验组（TGF-β1组），后根据1.4.3中步骤处理细胞；根据1.4.4项步骤，应用小干扰RNA构建阴性对照组（TGF-β1+siRNA-NC组）及应用siRNA-RUNX转染构建RUNX3沉默组（TGF-β1+siRNA-RUNX3组）。1.4.3HSCs的活化选取处于对数增殖期的HSCs，按照标准细胞传代流程将其接种于细胞培养皿，置于恒温CO2培养箱中进行常规培养。使用无血清DMEM/F-12培养基将贴壁细胞饥饿培养12 h，随后更换含5 ng/mL TGF-β1的无血清培养基，继续进行干预培养24 h。完成各实验组别处理后，采用胰酶消化法剥离贴壁细胞并进行离心（900 r/min，5 min）收集，所得细胞沉淀经PBS清洗后，分别进行总RNA抽提和Western blot等下游实验。1.4.4siRNA-RUNX3转染采用胰蛋白酶消化法终止对数增殖期HSCs的体外培养，经离心（900 r/min， 5 min）收集后以1×105个/mL密度制备单细胞悬液，分装接种至6孔培养板中，每孔定量注入2 mL细胞悬液。待细胞贴壁率达80%以上时，加入含5 ng/mL TGF-β1的诱导培养基进行活化干预，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中持续刺激24 h。完成细胞活化后，实验组严格参照吉玛基因转染试剂操作指南，将RUNX3特异性siRNA与转染复合物共孵育后注入对应孔位，同时设立空载体转染对照组，以及仅补充无血清培养基的基础对照组。所有处理组均于转染后4 h更换完全培养基，继续在标准培养条件下维持48 h以满足后续实验需求。所有处理组均设3次重复以确保数据可靠性。1.4.5Western blot检测经低温裂解处理（每孔加入含PMSF的RIPA裂解缓冲液100 μL）后，细胞样本于4 ℃摇床上轻摇持续裂解30 min。随后将完全裂解的细胞悬液转移至预冷离心管，离心（13 250 r/min， 30 min）以去除细胞碎片，离心后保留上清液进行蛋白浓度检测。采用BCA蛋白定量试剂盒对样本进行标准化定量分析，通过酶标仪测定562 nm波长吸光度值建立标准曲线。完成定量后，取等量蛋白样本进行凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜。转膜后依次用TBST缓冲液洗涤膜3次，5 %脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，TBST清洗后置于4 ℃摇床与特异性GAPDH一抗（1∶50 000）；α-SMA一抗（1∶5 000）、Collagen I一抗（1∶1 000）、RUNX3一抗（1∶2 000）孵育16 h，次日复温后TBST洗涤3次，与特异性鼠源、兔源二抗（1∶10 000）在室温摇床孵育1.5 h。最终经化学发光显影系统获取蛋白条带图像，使用ImageJ图像分析软件对目标条带与GAPDH内参进行灰度值定量分析，所有实验均设置3次重复以确保数据可靠性。1.4.6提取总RNA及逆转录按照上述实验步骤培养细胞，去除培养基后用PBS清洗2次，选用TRIzol法慢提RNA。1.4.7定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）按照上述实验步骤获取总RNA，用分光光度仪检测其浓度并按照试剂盒说明书逆转录，并用Bio-Rad CFX Maestrol 1.0 Real-Time系统对目的基因进行荧光定量检测。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。1.4.8免疫荧光HSCs细胞爬片用4 %多聚甲醛固定后，首先在0.5 % TritonX-100中透化。使用5% BSA进行阻断。然后将细胞爬片与α-SMA（1∶200）、RUNX3（1∶200）、Ki-67一抗（1∶200）在4 ℃下孵育过夜。洗涤后，将相应的鼠源、兔源二抗（1∶200）在室温下孵育1 h。细胞核用DAPI复染。使用荧光显微镜观察样品并拍照。1.4.9EdU染色用胰酶消化处于对数增殖期的细胞，适当稀释后以每孔约1.5×10⁴个细胞的密度接种于24孔培养板中并分组干预。实验过程中向各孔内添加含EdU的完全培养基（500 μL/孔），置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养2 h。标记结束后，采用PBS充分洗涤3次以去除未结合试剂。继而于室温条件下向各孔注入4%多聚甲醛溶液固定2 h，弃除固定液后PBS清洗3次。随后采用0.3% Triton X-100溶液透膜处理15 min，透膜完成后重复PBS洗涤步骤。严格参照试剂盒说明书配制Click染色反应混合液，避光条件下向各孔加入反应混合液300 μL/孔，于室温环境中孵育30 min。移除反应液后经PBS彻底漂洗3次，最终采用抗荧光淬灭封片剂与DAPI染色液实施核复染。染色程序完成后，即刻置于荧光显微镜下进行多视野图像采集，分析各组间荧光信号强度差异。1.4.10细胞划痕实验使用直尺在6孔培养板底部预先绘制3条等距平行基准线，随后按照实验设计将不同处理组的细胞悬液以标准化密度接种于孔内。待细胞单层生长至完全汇合后，采用200 μL微量移液器枪头沿垂直于孔板平面及预设标记线的方向施加恒定压力进行划痕操作，形成3条均匀的线性创面。弃去原有培养基后，采用无菌PBS轻柔洗涤3次以清除悬浮细胞碎片，更换新鲜3%完全培养基。使用倒置荧光显微镜进行0 h基线图像采集，随后将培养板置于恒温CO2培养箱继续培养。分别于处理后12 h及24 h时间点，对同一划痕区域进行动态观察，采用ImageJ图像分析软件对划痕边缘进行数字化标定，精确计算面积变化，以此量化评估细胞迁移速率。在每个孔中随机选取3个视野。1.4.11Transwell细胞迁移实验将Transwell细胞迁移实验体系置于24孔培养板内，上室加入500 μL无血清培养基平衡小室微环境后转移至37 ℃恒温培养箱预活化。取对数增殖期细胞经胰酶消化处理后，用无血清DMEM/F-12培养基制备单细胞悬液，细胞计数板计数。依据实验分组设计，以每孔1.5×104个细胞加样至Transwell上室，每组设立3个独立重复样本，下室同步注入500 μL含30 %胎牛血清的DMEM/F-12完全培养基作为趋化诱导体系。将培养系统置于37 ℃、5% CO2恒湿培养箱中持续孵育24 h后，用PBS清洗。随后于下室加入500 μL 4%多聚甲醛进行室温固定处理30 min，继而使用0.1%结晶紫染色液对细胞特异性染色30 min。充分清洗去除残留染液后，在倒置光学显微镜下系统观察细胞迁移状态，每个样本随机选取3个代表性显微视野进行图像采集，最终应用ImageJ图像分析软件对迁移细胞数量进行统计学定量分析。1.5统计学处理收集的数据用GraphPad Prism 9.0进行统计分析，数据以x¯±s表示，两组间比较采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用Tukey多重比较检验。以P0.05为差异有统计学意义，所有实验均独立重复3次以上。2结果2.1RUNX3在HSCs活化中的表达上调如图1所示，经TGF-β1刺激后的HSCs，RUNX3蛋白表达量较对照组升高（PTukey0.01），其mRNA转录水平亦明显升高（PTukey0.001）。值得注意的是，在采用siRNA-RUNX3转染后，TGF-β1+siRNA-RUNX3组较TGF-β1+siRNA-NC对照组表现出RUNX3蛋白表达抑制（PTukey0.05），且mRNA水平同步下调（PTukey0.01）。这为阐释RUNX3在HSCs活化过程中的分子调控机制提供了依据。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图 1RUNX3在不同分组中的表达 （x¯±s， n=3）Fig. 1Expression of RUNX3 in each group （x¯±s， n=3）A： The protein expression level of RUNX3 was detected by Western blot； B： The expression of RUNX3 mRNA was detected by RT-qPCR； a： Control group； b： TGF-β1 group； c： TGF-β1+siRNA-NC group； d： TGF-β1+siRNA-RUNX3 group；**P0.01，***P0.001 vs Control group； #P0.05， ##P0.01 vs TGF-β1+siRNA-NC group.2.2RUNX3促进HSCs纤维化相关基因中Collagen I、α⁃SMA mRNA的表达RT-qPCR（图2）结果显示，经TGF-β1处理的实验组后，Collagen I与α⁃SMA基因的mRNA表达水平较对照组明显上调（PTukey0.001）。相反地，使用TGF-β1+siRNA-RUNX3转染HSCs组中Collagen I、α⁃SMA的mRNA表达水平较TGF-β1+siRNA-NC组明显降低（均PTukey0.001）。该实验数据提示，沉默RUNX3可有效拮抗TGF-β1介导的促纤维化效应。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图 2RUNX3对HSCs中Collagen l、α⁃SMA mRNAFig. 2The effects of RUNX3 on the expression levels of Collagen I， α⁃SMA mRNA in HSCs （x¯±s， n=3）表达量的影响 （x¯±s， n=3）a： Control group； b：TGF-β1 group； c： TGF-β1+siRNA-NC group； d： TGF-β1+siRNA-RUNX3 group； ***P0.001 vs Control group； ###P0.001 vs TGF-β1+siRNA-NC group.2.3RUNX3调控Collagen I、α-SMA蛋白的表达Western blot结果显示（图3A）：TGF-β1刺激HSCs活化后，α-SMA、Collagen I蛋白水平较对照组明显升高（均PTukey0.001）；而使用TGF-β1+siRNA-RUNX3转染的RUNX3沉默组HSCs中Collagen I、α-SMA的蛋白表达水平相较于TGF-β1+siRNA-NC组表达明显降低（均PTukey0.001）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图 3RUNX3对Collagen I， α⁃SMA蛋白表达的影响 （x¯±s， n=3）Fig. 3The effects of RUNX3 on the expression of Collagen I and α⁃SMA proteins （x¯±s， n=3）A： The protein expression level of Collagen I and α-SMA were detected by Western blot； B： The expression of α-SMA and RUNX3 were detected by immunofluorescence ×200； a：Control group；b：TGF-β1 group； c：TGF-β1+siRNA-NC group；d： TGF-β1+siRNA-RUNX3 group；***P0.001， ****P0.000 1 vs Control group； ###P0.001， ####P0.000 1 vs TGF-β1+siRNA-NC group.同时，通过免疫荧光将α-SMA、RUNX3共染，结果如图3B所示，α-SMA与RUNX3在HSCs中表达不明显，但在TGF-β1处理后表达增加（均PTukey0.001）；与此同时，相比较与TGF-β1+siRNA-NC组，TGF-β1+siRNA-RUNX3组中α-SMA、RUNX3表达量明显降低（均PTukey0.001），证明靶向沉默RUNX3会抑制HSCs中纤维化相关蛋白的沉积。2.4RUNX3沉默抑制HSCs的增殖活性Ki-67免疫荧光染色实验（图4A）结果显示，用TGF-β1处理后的HSCs与对照组相比增殖活性明显升高（PTukey0.000 1）。同时，与TGF-β1+siRNA-NC组相比，TGF-β1+siRNA-RUNX3组中HSCs增殖活性明显降低（PTukey0.001）。图4B中EdU结果同样证实了上述观点，证明靶向沉默RUNX3将会抑制HSCs的增殖活性（PTukey0.01）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图 4RUNX3对HSCs增殖活性的影响 （x¯±s， n=3）Fig. 4The effects of RUNX3 on the proliferation activity of HSCs （x¯±s， n=3）A： The expression of Ki-67 was detected by immunofluorescence ×200； B： The cell proliferation activity was detected by EdU assay ×40； a： Control group； b： TGF-β1 group； c： TGF-β1+siRNA-NC group； d： TGF-β1+siRNA-RUNX3 group；****P0.000 1 vs Control group； ##P0.01， ###P0.001 vs TGF-β1+siRNA-NC group.2.5沉默RUNX3对HSCs迁移能力的影响细胞迁移功能检测数据如图5A所示，经TGF-β1干预的HSCs在细胞划痕实验中迁移活性明显增强（PTukey0.001）。同时，用siRNA-RUNX3转染后，HSCs的迁移进程受到明显阻滞（PTukey0.001），这提示RUNX3基因的沉默可有效逆转TGF-β1诱导的细胞促迁移作用。Transwell迁移实验定量分析结果（图5B）进一步证实，沉默RUNX3能够显著抑制HSCs的迁移能力，TGF-β1+siRNA-RUNX3组穿膜细胞数较TGF-β1+siRNA-NC减少（PTukey0.000 1），该数据验证了RUNX3在调控HSCs迁移中的促进作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图 5RUNX3对HSCs迁移能力的影响 （x¯±s， n=3）Fig. 5The effects of RUNX3 on the migration ability of HSCs （x¯±s， n=3）A： Wound-healing experiment ×10； B： Transwell experiment ×40；a： Control group； b： TGF-β1 group； c： TGF-β1+siRNA-NC group； d： TGF-β1+siRNA-RUNX3 group； ***P0.001， ****P0.000 1 vs Control group； ###P0.001， ####P0.000 1 vs TGF-β1+siRNA-NC group.3讨论越来越多的实验表明，转录因子RUNX3在各种疾病进展中发挥重要作用［7–9］。然而，RUNX3在各类疾病的发展进程中扮演着多样化的角色，展现出其复杂且关键的功能特性。Koyama et al［10］的研究表明，在人类乳腺癌相关成纤维细胞的肿瘤中过表达RUNX3会促进该肿瘤细胞的增殖、进展和恶性。相反，Torquati et al［6］在食管腺癌中发现RUNX3可以抑制细胞增殖。同时，Affandi et al［12］通过研究RUNX3在全身性硬化症的作用，发现RUNX3的低表达有助于增强纤维化。相反地，赵谦 等［13］的研究证明了RUNX3能够增强心脏成纤维细胞增殖，并且还参与了心脏成纤维细胞分化和增殖。在本研究中，通过对HSCs的研究发现，与对照组相比，RUNX3在TGF-β1诱导HSCs的细胞模型中表达量明显升高。另外，采用siRNA-RUNX3转染后降低了HSCs细胞中Collagen I、α-SMA的表达水平，这些结果表明RUNX3对HSCs活化过程具有促进作用。为深入探讨RUNX3在HF进程中的作用机制，本研究采用TGF-β1诱导HSCs活化构建体外模型，细胞划痕实验及Transwell迁移实验等定量分析表明，TGF-β1刺激组HSCs的增殖活性较对照组提高，其迁移能力亦显著增强。而RUNX3基因沉默后，细胞的增殖速率下降，迁移能力亦受到明显抑制，这进一步验证了RUNX3对HSCs活化过程的促进作用。基于上述实验结果，初步推测RUNX3可能通过调控特定纤维化相关基因靶标的转录或蛋白稳定性，从而影响HSCs的增殖与迁移等生物学行为。具体而言，该转录因子或通过增强促纤维化基因mRNA的翻译效率，或通过抑制相关蛋白的降解，最终导致细胞外基质过度沉积，促进HF的病理进程。然而，关于RUNX3介导的分子调控网络及其下游信号通路的具体作用机制，仍需进一步实验。该发现与已有研究（如肝细胞癌［14］、肾纤维化［15］）在对纤维化调控方向上存在分歧，由于本研究主要选用了HSCs的一种细胞系，该病理变化可能因细胞种类有所差异，同时，本研究选取TGF-β1刺激HSC活化来构建体外模型，细胞所处状态存在差异，均可能导致细胞作用的改变，接下来，本团队也将继续优化实验设计，构建多种体内外模型来深入研究RUNX3在HSCs活化以及HF中的作用机制。