肝细胞癌（hepatocelular carcinoma， HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第三大因素［1］。目前已成为男性癌症死亡的第二大原因［2］。HCC的危险因素包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染、食用黄曲霉毒素污染的食物、酗酒、吸烟和2型糖尿病［3］。HCC的发生是一个多步骤的生物学进程，众多信号通路参与该过程，包括WNT/ β-catenin、RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR等［4–6］。二肽基肽酶7（dipeptidyl peptidase 7， DPP7），一种脯氨酸裂解后的氨肽酶，也被叫作静止细胞脯氨酸二肽酶（QPP， DPP2， DPPⅡ），是脯氨酸切割后的氨肽酶，能够除去N-末端二肽的二肽基肽酶，它所编辑的蛋白属于一种可溶性蛋白质［7］。目前已被证实在淋巴细胞的凋亡中起作用［8］，而淋巴细胞的减少与癌症患者的不良结局密切相关。与此同时，淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡数量也随着肿瘤恶性程度的进展而增加［9］。目前，未有明确的机制阐述DPP7对HCC细胞增殖、转移以及上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进展的相关研究。1材料与方法1.1材料1.1.1临床样本本文中所收集的临床病理蜡块标本均来自安徽省第二人民医院病理科，其中正常肝脏组织标本79例，HCC组织样本102例，共计181例。同时收集新鲜HCC组织及癌旁正常组织样本6对。免疫组化结果判读由两位病理科中级职称医师独立评定，采用双盲原则。所有涉及临床患者样本均电话回访后在网上签署知情同意书。本研究经安徽医科大学生物医学伦理委员会审查并获得批准（伦理号：83240098）。1.1.2主要试剂及仪器DAB显色剂、逆转录试剂盒、RNA提取试剂盒、蛋白酶抑制剂、Lipofectamine 3000 转染试剂、0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM 培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：34065、4366596、12183555、36978、L300001、25200056、A5256701、11965092）；鼠抗人β-actin 抗体、SYBR Green试剂（上海生工生物工程股份有限公司，货号：D191048-0050、B110032-0050）；兔抗人抗体DPP7（中国Abnova公司，货号：H00029952-B01P）；青链霉素混合液、BCA蛋白提取试剂盒、ECL发光剂、S-vision免疫组化试剂盒、甲醛、结晶紫（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：G4003-100ML、G2026-200T、G2161-200ML、G1313-100T、G1101-500ML、G1014-50ML）。二氧化碳培养箱（日本三洋电机公司，型号：MCO-15AC）；电泳电转仪、脱色摇床（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-24FN、WD-9405H）；荧光显微镜（日本尼康公司，型号：EVOSM7000）。1.2方法1.2.1UALCAN、GEPIA 数据库分析研究选择UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）和GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）生物信息平台，基于RNA测序数据和HCC患者的临床资料，系统评估DPP7基因在正常肝组织与HCC组织中的mRNA表达差异，并进一步探讨其与患者临床预后的相关性。1.2.2免疫组化选取HCC组织及肝脏正常组织蜡块标本切片处理，使用S-vision免疫组化试剂盒及DAB显色剂对DPP7蛋白进行定量检测，DPP7抗体浓度按照1∶800稀释后覆盖于切片组织上，4 °C孵育过夜。第2天滴加二抗并进行DAB显色。判定标准：免疫组织化学染色结果按显色程度划分为三级：无着色（0分）；浅黄色（1分）；深褐色（2分）。阳性细胞比例评分标准为五级：无阳性细胞（0分）；阳性细胞比例≤20%（1分）；21%～50%（2分）；51%～75%（3分）；超过75%（4分）。最终评分由显色强度分值与阳性细胞比例分值相乘确定，并划分为三个等级：阴性（0分）；弱阳性（1～4分）；强阳性（5～8分）。1.2.3细胞培养选择人HCC细胞株MHCC97H培养于37 °C、5%CO2的恒温培养箱中，培养皿中加入含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液DMEM混合培养基，镜下观察细胞贴壁情况并及时进行培养基更换。MHCC97H细胞株购于美国细胞培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。1.2.4细胞转染选择处于生长对数期的MHCC97H细胞接种于6孔板，利用Lipofectamine 3000转染24 h后收取MHCC97H细胞蛋白，蛋白印迹法检测转染效率。购买上海吉玛生物公司DPP7的siRNA（si-DPP7-1、si-DPP7-2）。siRNA序列从TCGA数据库中选择。本实验设置实验组与对照组，对照组设置为未作处理的MHCC97H细胞组（si-NC）；实验组细胞转染si-DPP7-1及si-DPP7-2质粒，选取两组敲低效率不同的si-DPP7-1和si-DPP7-2进行转染。本研究中选用的si-RNA序列分别是si-DPP7-1（5′-GAAGCGTTCCGACAGATCA-3′）、si-DPP7-2（5′-CGTCTGGACCACTTCAACT-3′）。1.2.5蛋白提取及Western blot实验选择处于对数生长期的MHCC97H细胞提取蛋白：将培养皿用PBS液轻柔冲洗2遍；随后在培养皿中加入蛋白裂解液并放置在冰盒中（4 °C、20 min）；刮取皿中裂解的细胞碎片并放置于1 mL无酶EP离心管中，离心后收取上清液（1 200 r/min、4 °C离心10 min），95 °C水浴加热变性后保存于-20 °C冰箱。选择收取的蛋白样本进行标记上样（10% SDA-PAGE胶），转膜，5%脱脂牛奶封闭40 min（室温下），抗体孵育后进行显影，使用ImageJ软件对条带进行灰度分析。一抗（DPP7，1∶800）4 ℃孵育过夜，PBS清洗后室温孵育二抗（山羊抗兔IgG，1∶1 000）30 min，随后DAB显色，使用ImageJ软件对条带进行灰度分析。1.2.6RNA 提取及 qRT-PCR 检测选择处于对数生长期的MHCC97H细胞提取RNA：使用 TRIzol 试剂提取总RNA。制备cDNA后，依据qRT-PCR试剂盒说明书进行操作。每组设定3个平行副孔，以GAPDH为内参。1.2.7细胞增殖实验MTT法：将MHCC97H细胞经胰酶消化并计数，接种至96孔培养板（每孔约1 000个细胞），设置重复孔。待细胞贴壁后移除原培养基，加入100 μL MTT溶液培养箱中孵育1 h。采用酶标仪检测570 nm处吸光度（Absorbance， A）值，收集数据并制图。细胞克隆形成实验：选取MHCC97H细胞经胰酶消化后制备单细胞悬液。细胞接种于6孔板，放置培养箱中培养2周；期间更换培养基，镜下观察单克隆集落。PBS溶液漂洗2次，多聚甲醛固定后结晶紫溶液染色10 min；细水流缓慢冲洗、室温晾干并拍照。划痕愈合实验：选择对数生长期MHCC97H细胞（镜下观察约铺满细胞培养皿80%），胰酶消化制备单细胞悬液并计数。制备成均匀单细胞悬液后将细胞接种于6孔板中（每孔约接种1×105个），贴壁培养直至长满；选用10 μL无酶枪头，在6孔板内划“井”字划痕后继续在温箱中培养。及时更换新培养基，拍照并记录细胞划痕愈合情况。1.2.8细胞转移能力实验将MHCC97H细胞经胰酶消化并计数，接种至24孔培养板并设置重复孔。细胞侵袭实验：24孔板内加入700 μL含10%胎牛血清的完全培养基，Transwell上室加入300 μL无血清培养基混悬的细胞悬液（含5×104个细胞），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，采用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色后于倒置显微镜下观察并采集图像。细胞迁移实验：预先2 h在Transwell上室铺Matrigel基质胶，随后加入300 μL无血清培养基的细胞悬液（含5×104个细胞），相同条件下培养48 h后甲醛固定、结晶紫染色及显微镜下观察并拍照。1.3统计学处理使用GraphPad Prism 10.1软件进行数据统计分析，实验均重复3次以上。定性数据以n （%）表示，定量数据以（x¯±s） 表示。两组间构成比的比较使用卡方检验，正态分布且方差齐的组间两两均值比较使用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1DPP7蛋白UALCAN、GEPIA数据库中的表达情况通过UALCAN数据库检索并分析后发现，371例HCC组织中DPP7蛋白表达高于50例正常肝组织中的DPP7蛋白表达（图1A，P0.01）。同时在UALCAN数据库中证实与健康患者相比较，HCC患者中DPP7蛋白的甲基化程度相对低（图1B，P0.01），致使其恶性程度高，进而促进肿瘤发展，这与图1A结论一致。基线分析GEPIA数据库证实DPP7基因表达水平在HCC组织中显著高于正常肝组织（图2，P0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1UALCAN数据库中检测DPP7表达情况Fig.1DPP7 expression was detected in the UALCAN databaseA： Detection of DPP7 protein expression in UALCAN database； B： The methylation level of the DPP7 promoter in HCC in the UALCAN database； **P0.01 vs Normal group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2GEPIA数据库中DPP7基因在临床样本中的表达差异Fig.2Expression differences of DPP7 in clinical samples，analyzed based on GEPIA database*P0.05 vs Normal group.2.2DPP7蛋白在临床组织样本中的表达本研究共纳入181份组织标本（102例HCC和79例正常肝组织样本）。通过免疫组化分析发现，与正常肝组织相比，HCC标本中DPP7蛋白的表达阳性率更高。且两组间表达差异有统计学意义（图3、表1，P0.01）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3DPP7蛋白在肝癌及正常肝组织中的表达Fig.3Expression of DPP7 protein in liver cancer and normal liver tissueExpression of DPP7 protein in Hepatocellular carcinoma tissues and Liver benign tissues detected by immunohistochemical staining ×100.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1DPP7蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达 ［n （%）］Tab.1Expression of DPP7 in hepatocellular carcinoma tissues and liver benign tissuesGroupnExpression of DPP7P valueχ2 valuePositiveNegativeHepatocellular carcinoma tissues10285 （83.33）17 （16.67） 0.0125.376Liver benign tissues7938 （48.10）41 （51.90）［n （%）］除此之外，DPP7蛋白高表达与患者的TNM分期（P = 0.002）、淋巴结转移（P = 0.038）和肿瘤浸润深度（P = 0.027）呈正相关（均P0.05，表2）。Western blot结果显示，选取的6对临床样本中，DPP7蛋白在HCC组织中表达显著高于正常肝组织，差异有统计学意义（图4，t=6.548，P0.01）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T002表2HCC患者中DPP7表达与临床病理参数的关系 ［n （%）］Tab.2Association of DPP7 expression with clinicopathologicalparameters in HCC patients ［n （%）］ParameternPositive expression （n=85）P valueχ2 valueHigh （n=45）Low （n=40）Age （years）0.8810.022553820 （52.63）18 （47.37）≥554925 （51.02）24 （48.98）Tumor diameter （cm）0.6730.17855329 （54.72）24 （45.28）≥53216 （50.00）16 （50.00）TNM stage0.0029.890Ⅰ4215 （35.71）27 （64.29）Ⅱ-Ⅳ4330 （69.77）13 （30.23）Lymph node metastasis0.0384.289Yes4227 （64.29）15 （35.71）No4318 （41.86）25 （58.14）Tumor infiltration depth0.0274.919High5132 （62.75）19 （37.25）Medium or low3413 （38.24）21 （61.76）10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4DPP7蛋白在临床肝癌样本及正常肝组织中的表达Fig.4Expression of DPP7 protein in clinical liver cancer samples and normal liver tissueN： Normal group； T： Tumor group； #1-#6： Six pairs of tissue samples from clinical patients were selected and numbered； **P0.01 vs Normal group.2.3DPP7对肝细胞癌细胞增殖能力的影响选取生长状态良好的HCC细胞株MHCC97H瞬时转染si-DPP7和si-NC后进行细胞功能试验。Western blot实验验证si-DPP7-1和si-DPP7-2的转染效率，结果显示si-DPP7质粒可稳定敲低DPP7蛋白表达（图5A，t=91.80、187.00，P0.001），同时在mRNA水平证实si-DPP7-1、si-DPP7-2质粒的效率相类似（图5B，t=64.95、49.10，P0.001）；MTT实验表明转染si-DPP7后细胞的增殖能力受抑制（图6A，F=21.21、112.80，P0.05，P0.01）；克隆形成实验表明抑制DPP7蛋白表达可减慢细胞集落形成速度（图6B，t=15.29、19.21，均P0.01），每组实验均重复3次。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5敲低DPP7后肝癌细胞MHCC97H中DPP7蛋白（A）和mRNA（B）的表达Fig.5Expression of DPP7 protein （A） and mRNA （B） in MHCC97H cells following DPP7 knockdown***P0.001 vs si-NC group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F006图6敲低DPP7蛋白抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖能力 ×100Fig.6DPP7 knockdown inhibited the proliferation of MHCC97H cells ×100A： MTT assay indicated that the proliferation ability of cells was inhibited after transfection with si-DPP7； B： Colony formation assay showed that DPP7 inhibition decreased the rate of colony formation； *P0.05， **P0.01 vs si-NC group.2.4DPP7对MHCC97H细胞划痕愈合能力的影响细胞划痕实验结果显示，与si-NC组相比，转染si-DPP7-1、si-DPP7-2组细胞愈合率降低（图7，t=5.635、8.914，P0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F007图7划痕实验检测DPP7对MHCC97H细胞划痕愈合能力的影响 ×50Fig.7Scratch assay to detect the effects of DPP7 on the scratch healing ability of MHCC97H cells ×50*P0.05 vs si-NC group.2.5DPP7对MHCC97H细胞转移能力的影响为探究DPP7对MHCC97H细胞侵袭和迁移能力的影响，Transwell实验结果显示，与si-NC组相比，转染si-DPP7质粒的MHCC97H细胞迁移和侵袭数量明显减少（图8，t=14.50、21.00、9.95、19.26，均P0.01）。证实敲低DPP7能够显著抑制MHCC97H细胞的侵袭和迁移特性。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F008图8Transwell实验检测DPP7对MHCC97H细胞转移能力的影响 ×100Fig.8Transwell assay was used to detect the effect of DPP7 on MHCC97H cell transfer ability ×100**P0.01 vs si-NC group.2.6DPP7对肝细胞癌细胞EMT相关分子的影响选择MHCC97H细胞株转染si-NC和si-DPP7质粒后，利用Western blot实验检测EMT相关蛋白标志物的表达水平。结果显示，si-DPP7-1和si-DPP7-2组间充质标志物N-cadherin、Vimentin表达下降（图9A、9B、9D，t=85.42、60.47、64.35、238.00，均P0.01），而上皮细胞标志物E-cadherin表达增加（图9C，t=21.50、52.00，均P0.001）。该结果表明在MHCC97H细胞株中敲低DPP7表达抑制EMT进程。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F009图9Western blot法检测MHCC97H细胞株中DPP7敲低后EMT相关蛋白表达Fig.9Western blot analysis showed the expression of EMT-related proteins after the knockdown of DPP7 in MHCC97H cell linesA： The expression of EMT-related proteins after the knockdown DPP7 in MHCC97H cell lines； B： Statistical graph of N-cadherin expression among EMT-elated proteins； C： Statistical graph of E-cadherin expression among EMT-related proteins； D： Statistical graph of Vimentin expression among EMT-related proteins； **P0.01，***P0.001 vs si-NC group.3讨论HCC是中国常见的恶性肿瘤，具有高侵袭性、易早期转移等生物学特征，这导致HCC患者预后较差［10］。因此，早期诊断和及时干预治疗对提高HCC患者的预后具有生物学意义。DPP7是二肽基肽酶家族的一员，因其在蛋白质降解和肽加工中的酶活性而被研究。近年来，DPP7在消化道肿瘤中的作用被广泛关注。目前已有研究［11–12］报道，DPP7可作为胃癌早期诊断和结直肠癌预后的生物标志物。相关研究［13］显示增强DPP7表达能够抑制肿瘤微环境中免疫细胞对结直肠癌细胞的细胞毒性功能，从而增强结直肠癌细胞的恶性增殖和远处侵袭能力。同时，DPP7与GPX4相结合保护结直肠癌细胞免受葡萄糖剥夺诱导的双硫死亡杀伤，从而促进结直肠癌进展［14］。然而，DPP7在HCC恶性进展中的作用，仍未得到充分探索。本研究在UALCAN和GEPIA数据库中检测DPP7在HCC中的表达情况。结果显示，基线分析UALCAN、GEPIA数据库证实DPP7基因表达水平在HCC组织中显著高于正常肝组织。同时与健康患者相比较，HCC患者中DPP7蛋白甲基化程度相对低致使其恶性程度高，进而促进肿瘤发展。随后，采用免疫组化、Western blot法和qPCR对HCC组织及正常肝组织进行检测，结果显示在蛋白和mRNA水平上，DPP7均在HCC组织中呈高表达，这与数据库中保持一致。本研究结果证实DPP7参与HCC患者肿瘤进展并且可作为HCC患者的潜在生物标志物。本研究在细胞层面对DPP7在HCC中的功能进一步探讨。选取公共数据库中选取si-DPP7质粒并检测其转染效率后进行功能试验。MTT实验、克隆形成实验均证实抑制DPP7蛋白表达后，HCC细胞MHCC97H的增殖能力受抑制。同时，选择划痕愈合实验和Transwell实验检测HCC细胞MHCC97H的转移能力并证实敲低DPP7蛋白表达后，细胞迁移和侵袭能力都受到抑制。在肿瘤进展和转移过程中EMT的异常激活与肿瘤细胞的侵袭性和肿瘤干性的恶性增强密切相关［15］。相关文献［12］报道，DPP7在结直肠癌中通过上调程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）表达水平，介导巨噬细胞M2表型极化，促进肿瘤细胞免疫逃逸并激活EMT进程，推动结直肠癌细胞迁移侵袭。至此，本研究推测DPP7促进HCC细胞恶性进展与EMT进程相关。上述研究结果提示，DPP7可借助激活EMT进程推动HCC恶性进展，但具体作用机制仍需进一步研究。尽管，近年来医学的发展在一定程度上延长HCC患者的总体生存期，但HCC的发病率和病死率仍然居高不下，临床上仍缺乏疗效好、副作用小的治疗药物［16］。综上，本研究通过生物学信息分析及相关实验证实DPP7在HCC组织中表达上调，且与HCC患者的不良预后相关。在HCC细胞MHCC97H中敲低DPP7表达可抑制细胞增殖、转移能力，其机制可能与EMT密切相关。至此，本研究揭示DPP7在HCC中的促癌作用，提示其可作为HCC潜在的治疗干预靶点。