胃癌是全球癌症致死的主要原因之一，由于其发病隐匿且缺乏早期诊断靶标，多数患者确诊时已处于中晚期，导致预后不良［1］。肿瘤的进展与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）密切相关，其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是关键的免疫细胞，可极化为抗肿瘤的M1表型或促肿瘤的M2表型，后者通过分泌细胞因子促进胃癌细胞恶性进展［2–3］。长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）是重要的调控分子，常通过充当“分子海绵”竞争性吸附miRNA影响TME［4］。例如，LncRNA NR_109和LncRNA CRNDE已被证实通过诱导TAM的M2型极化促进胃癌进展［5–6］。长链间隔非编码RNA02086（long intergenic non coding RNA02086，LINC02086）是近年来被关注的LncRNA，在胰腺癌等多种消化道癌中高表达，并促进其发展［7］。在胃癌中，LINC02086特异性高表达，可通过吸附miR-93a-5p上调基质金属蛋白酶3 （matrix metalloproteinase-3，MMP3）表达，进而激活细胞外基质重塑通路，推动胃癌细胞增殖和迁移［8］ 。然而，LINC02086是否通过调控巨噬细胞极化影响胃癌进展尚未明确。该研究拟探讨LINC02086过表达对巨噬细胞极化及胃癌细胞恶性行为的影响与机制，旨在为胃癌诊断和治疗提供新的潜在靶点。1材料与方法1.1细胞人急性单核细胞白血病细胞THP-1、人胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞HCG-27、NCI-N87、AGS（货号：h213、h062、h095、h164、h016）购自上海赛百慷生物技术股份有限公司。1.2主要试剂和仪器RPMI-1640培养基、DMEM培养基（货号：SH30809、SH30243）购自美国Hyclone公司；F12K培养基、青-链霉素双抗（货号：PM150910B、PB180120）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）（货号：P1585）购自美国Sigma公司；Wnt/β-catenin通路抑制剂IWR-1（货号：HY-12238）购自美国MedChemExpress公司；FITC标记的甘露糖受体（mannose receptor C-type 1，CD206）流式抗体以及用于Western blot的抗CD206、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Wnt家族成员3a（Wnt family member 3a，Wnt3a）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、β-连环蛋白（β-catenin）、GAPDH抗体（货号：ab270647、ab64693、ab46154、ab219412、ab93926、ab32572、ab8245）购自英国Abcam公司；结晶紫、CCK-8试剂盒（货号：Y268091、C0038）购自上海碧云天生物技术有限公司；荧光显微镜（型号：CX23）购自日本OLYMPUS公司；实时荧光定量PCR仪（型号：LightCycler 96）购自瑞士Roche公司；流式细胞仪（型号：CytoFLEX）购自美国Beckman Coulter公司；全波长酶标仪（型号：Multiskan SkyHigh）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；凝胶成像仪（型号：Gel Doc EZ）购自美国Bio-Rad公司。1.3方法1.3.1细胞培养在5% CO2、37 ℃的培养箱中，分别使用含有10%胎牛血清和1%双抗（青-链霉素）的RPMI-1640完全培养基培养THP-1、GES-1及NCI-N87细胞，使用DMEM完全培养基培养HGC-27细胞，使用F12K完全培养基培养AGS细胞。THP-1细胞生长至8×105个/mL时进行传代，其余细胞融合度生长至80%～90%时进行传代。1.3.2慢病毒感染构建LINC02086慢病毒过表达载体（pLVX-Puro），经过慢病毒包装、纯化及浓缩得到相应慢病毒溶液（滴度1×108 TU/mL）。按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）为30的LINC02086过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒感染HGC-27细胞，经过嘌呤霉素筛选得到稳定过表达LINC02086的HGC-27细胞系，分别命名为Vector组和OE-LINC02086组，另设置空白对照组（Blank）。LINC02086慢病毒过表达载体构建、病毒包装、纯化及浓缩由苏州赛业生物科技有限公司完成并提供。1.3.3M0型巨噬细胞诱导及条件培养基（conditioned medium，CM）获取体外培养THP-1细胞，加入10 nmol/L PMA诱导48 h后得到未分化的M0型巨噬细胞［9］。将感染慢病毒后的HGC-27细胞置于无血清RPMI-1640培养基中培养24 h，收集上清液，经过0.45 μmol/L滤膜过滤得到条件培养基CM1，分别命名为Vector+CM1、OE-LINC02086+CM1，另设置空白对照CM1（Blank+CM1）；在Transwell体系中进行细胞共培养［10］，分别将感染慢病毒后的HGC-27细胞接种于6孔板底部，将M0型巨噬细胞接种于与之匹配的Transwell小室中，待二者分开培养至贴壁后，将培养M0型巨噬细胞的小室移至培养HGC-27细胞的6孔板中建立共培养体系，无血清培养基共培养24 h，收集上清液得到条件培养基CM2，分别命名为Vector+CM2、OE-LINC02086+CM2，另设置空白对照CM2（Blank+CM2）。该研究中，CM1用于评估LINC02086过表达的胃癌细胞自身分泌因子对巨噬细胞的直接作用，CM2用于模拟TME中胃癌细胞与巨噬细胞双向交互后的状态，其中包含了被胃癌细胞诱导M2极化后的巨噬细胞所反馈分泌的因子。1.3.4细胞分组及处理采用qRT-PCR检测GES-1、HCG-27、NCI-N87及AGS细胞中的LINC02086表达水平。对HGC-27细胞进行以下分组及处理：① Control-1组：M0型巨噬细胞不经任何处理；Blank+CM1组、Vector+CM1组、OE-LINC02086+CM1组：使用对应来源的CM1刺激M0型巨噬细胞24 h；Vector+CM1+IWR-1组、OE-LINC02086+CM1+IWR-1组：使用10 μmol/L IWR-1［11］预处理M0型巨噬细胞2 h后，再使用对应来源的CM1刺激M0型巨噬细胞24 h；② Control-2组：HGC-27细胞不经任何处理；Blank+CM2组、Vector+CM2组、OE-LINC02086+CM2组：使用对应来源的CM2处理HGC-27细胞24 h；Vector+CM2+IWR-1组、OE-LINC02086+CM2+IWR-1组：使用10 μmol/L IWR-1预处理M0型巨噬细胞2 h后，再使用对应来源的CM2刺激M0型巨噬细胞24 h。1.3.5流式细胞术检测CD206阳性细胞比例收集各组巨噬细胞至流式测定管中，1 500 r/min离心3 min后去除培养基，加入PBS重悬细胞，使其浓度达到1×106个/mL。4%多聚甲醛固定细胞15 min后破膜，使用1%的牛血清白蛋白封闭液封闭细胞表面非特异性结合位点，加入FITC-CD206抗体，避光孵育30 min，于流式细胞仪上检测各组CD206阳性细胞比例。1.3.6qRT-PCR收集各组HGC-27细胞和巨噬细胞，加入TRIzol试剂使细胞充分裂解，使用氯仿和异丙醇溶液对RNA进行分离，检测RNA浓度后，根据反转录试剂盒说明书操作进行cDNA合成。设计引物（表1），配置包含2×SYBR扩增预混液、引物混合物、cDNA模板和无酶水的PCR反应体系，于实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循环40次。根据扩增和熔解曲线，以GAPDH作为对照，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1引物序列Tab. 1Primer sequencesGenePrimer sequence （5′⁃3′）LINC02086F： TCCCTTGGAGGTATTGACR： CTCAGAACAACCGATGACIL⁃10F： AGAACCTGAAGACCCTCAGGCR： CCACGGCCTTGCTCTTGTTTGF⁃βF： TACCTGAACCCGTGTTGCTCTCR： GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAAVEGFF： CAGGGACAGTTGCTTCTGGAR： CAGGGACAGTTGCTTCTGGACCL22F： GAGATCTGTGCCGATCCCAGR： AGGGAATGCAGAGAGTTGGCGAPDHF： AATCCCATCACCATCTTCR： AGGCTGTTGTCATACTTC1.3.7CCK-8实验将对数生长期的HGC-27细胞接种于96孔板中，每孔3×103个/100 μL，待细胞贴壁后按照分组要求进行处理，随后每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻振荡混匀，继续孵育1 h，于酶标仪波长450 nm处检测各孔吸光度（Absorbance，A）值。细胞增殖活性（%）=（实验孔A值 -空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。1.3.8Transwell实验按照分组要求对HGC-27细胞进行处理，随后分别进行迁移和侵袭实验。迁移实验：将细胞接种于Transwell上室中的无血清培养基中进行培养，将含有20%胎牛血清的DMEM培养基添加到Transwell下室中，将孔板置于培养箱中培养24 h后，取出小室，经过4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色，于显微镜下进行拍照和计数，对迁移细胞的数量进行统计。侵袭实验：提前在小室中铺入50 μL基质胶，后续步骤同迁移实验。1.3.9Western blot实验收集各组巨噬细胞和HGC-27细胞，加入裂解缓冲液后4 ℃振荡、1 500 r/min离心3 min取上清液，对蛋白质浓度进行测定。将40 μg蛋白质上样至SDS-PAGE凝胶中（100 V分离1 h），随后转至PVDF膜上（60 V转膜2 h），将膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，加入1∶1 000稀释后的一抗（Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CD206、VEGF、GAPDH）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀释后的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗室温孵育1 h，加入ECL化学发光底物进行显色，ImageJ软件分析条带，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。1.4统计学处理使用SPSS 26.0软件分析数据，结果用均数±标准差（x¯±s）表示。多组均数比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1胃癌HGC-27细胞中LINC02086表达水平及其过表达对M0型巨噬细胞M2极化的影响采用qRT-PCR检测各细胞系及慢病毒感染后HGC-27细胞中的LINC02086表达水平，结果显示（图1），与GES-1细胞比较，HCG-27、NCI-N87及AGS细胞中LINC02086表达水平均升高（均P0.01，LSD-t=9.67、37.53、24.26），其中HCG-27细胞升高幅度最小。感染慢病毒后，与Blank组比较，OE-LINC02086组HGC-27细胞中LINC02086表达水平升高（P0.01，LSD-t=31.09），Vector组差异无统计学意义（P0.05，LSD-t=0.04）。采用不同来源的CM1刺激M0型巨噬细胞，结果显示（图2），与Control-1组比较，Blank+CM1组巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平均升高（均P0.05，LSD-t=12.61、5.59、3.44、5.80、2.52）；与Blank+CM1组比较，OE-LINC02086+CM1组巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平均升高（均P0.05，LSD-t=12.73、8.87、13.44、3.20、14.85），Vector+CM1组以上指标差异无统计学意义（P0.05，LSD-t=0.07、0.20、0.67、0.40、0.18）。提示LINC02086过表达可促进巨噬细胞向M2型极化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1qRT-PCR检测细胞中LINC02086表达水平Fig. 1The expression level of LINC02086 in cells was detected by qRT-PCRA： Expression levels of LINC02086 in each cell line； B： Expression levels of LINC02086 in cells after lentivirus infection； a： GES-1 cells； b： HGC-27 cells； c： NCI-N87 cells； d： AGS cells； e： Blank group； f： Vector group； g： OE-LINC02086 group； **P0.01 vs GES-1 cells； ##P0.01 vs Blank group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图2胃癌HGC-27细胞中LINC02086过表达对M0型巨噬细胞的影响Fig. 2The effects of LINC02086 overexpression in gastric cancer HGC-27 cells on M0 type macrophagesA， B： CD206 levels in cells of each group； C， D： IL⁃10， TGF⁃β， VEGF and CCL22 mRNA expression levels in cells of each group； a： Control-1 group； b： Blank+CM1 group； c： Vector+CM1 group； d： OE-LINC02086+CM1 group； *P0.05， **P0.01 vs Control-1 group； #P0.05， ##P0.01 vs Blank+CM1 group.2.2LINC02086过表达介导的巨噬细胞M2极化对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响采用不同来源的CM2刺激HGC-27细胞，结果显示（图3），与Control-2组比较，Blank+CM2组HGC-27细胞增殖活性升高（P0.05，LSD-t=2.43），迁移、侵袭细胞数量增加（均P0.05，LSD-t=3.39、2.53）；与Blank+CM2组比较，OE-LINC02086+CM2组HGC-27细胞增殖活性升高（P0.01，LSD-t=3.81），迁移、侵袭细胞数量进一步增加（P0.01，LSD-t=12.83、12.32），Vector+CM2组以上指标差异无统计学意义（P0.05，LSD-t=0.31、1.18、0.63）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图3LINC02086过表达介导的巨噬细胞M2极化对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响Fig. 3The effects of M2 polarization of macrophages mediated by LINC02086 overexpression on the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cellsA： Cell proliferation activity in each group； B： Number of migrating cells in each group； C： Number of invasive cells in each group； D： Transwell assay was used to detect cell migration and invasion ×200； a： Control-2 group； b： Blank+CM2 group； c： Vector+CM2 group； d： OE-LINC02086+CM2 group； *P0.05， **P0.01 vs Control-2 group； ##P0.01 vs Blank+CM2 group.2.3 LINC02086过表达通过激活Wnt/β-catenin通路促进巨噬细胞向M2型极化采用不同来源的CM1刺激M0型巨噬细胞，结果显示（图4），与Control-1组比较，Blank+CM1组巨噬细胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平升高，GSK-3β蛋白表达水平降低（均P0.01，LSD-t=14.25、7.25、3.83）；与Blank+CM1组比较，OE-LINC02086+CM1组巨噬细胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平升高，GSK-3β蛋白表达水平降低（均P0.01，LSD-t=7.00、12.25、10.67），Vector+CM1组以上指标差异无统计学意义（P0.05，LSD-t=1.00、0.33、0.50）。采用不同来源的CM1联合IWR-1刺激M0型巨噬细胞，结果显示（图5），与Vector+CM1组比较，Vector+CM1+IWR-1组巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平均降低（均P0.05，LSD-t=7.37、3.46、2.38、3.24、2.53），同时，细胞中β-catenin、CD206和VEGF蛋白表达水平均降低（均P0.05，LSD-t=3.75、3.83、2.60）；OE-LINC02086+CM1组巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平均升高（均P0.01，LSD-t=11.18、31.05、23.43、25.95、12.35），同时，细胞中β-catenin、CD206和VEGF蛋白表达水平均升高（均P0.01，LSD-t=16.75、12.00、13.20）；与OE-LINC02086+CM1组比较，OE-LINC02086+CM1+IWR-1组巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平均降低（均P0.01，LSD-t=8.01、27.64、18.10、9.76、4.24），同时，细胞中β-catenin、CD206和VEGF蛋白表达水平均降低（均P0.01，LSD-t=9.75、6.83、6.00）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4胃癌来源CM1对巨噬细胞中Wnt/β-catenin通路的影响Fig. 4The effects of gastric cancer derived CM1 on Wnt/β-catenin pathway in macrophagesa： Control-1 group； b： Blank+CM1 group； c： Vector+CM1 group； d： OE-LINC02086+CM1 group； **P0.01 vs Control-1 group； ##P0.01 vs Blank+CM1 group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5CM1联合Wnt/β-catenin通路抑制剂对巨噬细胞向M2型极化的影响Fig. 5The effects of CM1 combined with Wnt/β-catenin pathway inhibitors on the M2 polarization of macrophagesA： CD206 levels in cells in each group； B： mRNA expression levels of M2-type macrophage-associated cytokines in cells in each group； C： Protein expression of β-catenin， CD206 and VEGF levels in cells in each group； a： Vector+CM1 group； b： Vector+CM1+IWR-1 group； c： OE-LINC02086+CM1 group； d： OE-LINC02086+CM1+IWR-1 group； *P0.05， **P0.01 vs Vector+CM1 group； ##P0.01 vs OE-LINC02086+CM1 group.2.4阻断Wnt/β-catenin 通路抑制LINC02086过表达介导的巨噬细胞M2极化对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响采用不同来源的CM2联合IWR-1刺激HGC-27细胞，结果显示（图6），与Vector+CM2组比较，Vector+CM2+IWR-1组HGC-27细胞增殖活性降低（P0.05，LSD-t=3.22），迁移、侵袭细胞数量减少（均P0.01，LSD-t=5.01、5.95）；且OE-LINC02086+CM2组HGC-27细胞增殖活性升高（P0.01，LSD-t=5.50），迁移、侵袭细胞数量增加（均P0.01，LSD-t=17.43、10.85）。与OE-LINC02086+CM2组比较，OE-LINC02086+CM2+IWR-1组HGC-27细胞增殖活性降低（P0.01，LSD-t=4.42），迁移、侵袭细胞数量减少（均P0.01，LSD-t=8.71、8.01）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F006图6阻断Wnt/β-catenin 通路抑制LINC02086过表达介导的巨噬细胞M2极化对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响Fig. 6Blocking Wnt/β-catenin pathway inhibited the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells by inhibiting the M2 polarization of macrophages mediated by LINC02086 overexpressionA： Cell proliferation activity in each group； B： Number of migrating cells in each group； C： Number of invasive cells in each group； D： Transwell assay was used to detect cell migration and invasion ×200； a： Vector+CM2 group； b： Vector+CM2+IWR-1 group； c： OE-LINC02086+CM2 group； d： OE-LINC02086+CM2+IWR-1 group； *P0.05， **P0.01 vs Vector+CM2 group； ##P0.01 vs OE-LINC02086+CM2 group.3讨论TAM是TME中重要的先天免疫细胞群之一，参与刺激肿瘤的慢性炎症、血管生成以及癌细胞免疫逃逸、侵袭和转移［12］。近年来，靶向TAM干预胃癌的进展受到关注，通过介导肿瘤与TAM之间的相互作用可以抑制或促进胃癌细胞转移，然而其具体的分子机制仍有待进一步深入阐明［13］。巨噬细胞作为机体免疫系统的核心成员，其表型分化和功能重塑受到周围微环境调节。在病原体侵袭过程中，巨噬细胞一方面迅速对病原体发生免疫和炎症反应，一方面对组织进行修复和重塑，这些功能分别由M1型和M2型两种不同亚型的巨噬细胞主导，两种极化状态可通过相互转换维持细胞稳态。M2型TAM在TME中占优势地位，通过增加TGF⁃β和VEGF含量促进血管内皮细胞活性，导致癌细胞的快速生长和远处转移，而癌细胞反过来又通过分泌高水平的CCL22等趋化因子来募集和扩增TAM，造成恶性循环［14–15］。钟裕昌 等［16］研究显示，M2型TAM可促进胃癌细胞的侵袭和迁移，过表达M2型TAM中的TIA1基因可通过阻断磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路抑制胃癌细胞侵袭和迁移。本研究采用CM1诱导M0型巨噬细胞以模拟胃癌肿瘤环境，结果显示，巨噬细胞中CD206水平以及IL⁃10、TGF⁃β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平较Blank组均显著升高，说明肿瘤环境中的巨噬细胞向M2型极化。近年来，LINC02086展现出的在胰腺癌［7］、乳腺癌［17］、肺腺癌［18］等肿瘤中的治疗潜力引起关注，并被预测可作为胃癌预后的潜在生物标志物［8］，但其在胃癌中的作用和机制还需进一步验证。本研究证实LINC02086在胃癌细胞系中高表达，并选择表达水平相对较低的HGC-27细胞进行慢病毒介导的过表达，以探究LINC02086对胃癌细胞恶性表型的影响及其机制。进一步研究发现，LINC02086过表达能诱导巨噬细胞向M2型极化；在此基础上，通过收集极化后巨噬细胞的条件培养基（CM2）模拟肿瘤微环境中的反馈作用，验证了LINC02086通过介导巨噬细胞M2极化，进而促进胃癌HGC-27细胞增殖、迁移及侵袭的作用。巨噬细胞极化受Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR、Notch等经典信号通路以及细胞因子微环境、外泌体介导的细胞间通讯的精密调控，Wnt/β-catenin通路尤为重要［19］。Wnt3a作为Wnt家族中的关键配体，与其共受体结合后激活支架蛋白Disheveled，通过解离GSK-3β和酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）形成的复合体，使胞质β-catenin蛋白入核启动靶基因转录，诱导后续细胞反应［20］。一方面，TAM来源的VEGF通过Wnt/β-catenin通路以自分泌和旁分泌的方式促进肿瘤干性［21］；另一方面，肿瘤细胞释放的Wnt配体亦可激活该通路，诱导TAM向M2型极化进而促进癌细胞生长和转移［22］。LINC00662被报道可通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导巨噬细胞M2型极化促进肝癌转移［23］。而本研究发现，LINC00662过表达能激活Wnt/β-catenin通路，诱导巨噬细胞M2极化并增强HGC-27细胞的恶性表型；而使用该通路抑制剂则可逆转上述效应。说明LINC02086可能通过调控Wnt/β-catenin通路介导巨噬细胞M2极化促进胃癌细胞增殖和转移。综上所述，LINC02086过表达可促使巨噬细胞向M2型分化，并进一步促进胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与激活Wnt/β-catenin通路有关，本研究为LINC02086作为胃癌诊疗靶点提供了依据。但研究中还存在一定局限性，例如，沉默LINC02086是否可抑制胃癌细胞的增殖及转移，该过程中是否还涉及其他机制，都还需进行进一步探索。