慢性炎症是病理复杂的炎症反应［1］，涉及多种细胞类型和分子机制［2–3］。在慢性炎症过程中，经典活化的 M1 型巨噬细胞可大量释放促炎性细胞因子，进而加剧炎症的进展与恶化［4］。Lck/Yes 相关新型酪氨酸激酶（Lck/Yes-related novel protein tyrosine kinase，Lyn）作为非受体型酪氨酸激酶家族成员［5］，在慢性炎症中发挥调控作用。研究［6–7］表明，Lyn的表达水平及活性与巨噬细胞的功能状态密切相关。Lyn可通过激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路，磷酸化 髓样分化因子 88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）等下游适配分子启动炎症信号级联反应，上调促炎因子表达，最终介导 M1 型巨噬细胞的促炎免疫应答。此外，Lyn 还参与调控巨噬细胞的吞噬功能与细胞因子分泌过程，是介导巨噬细胞极化的重要分子［8–11］。目前，Lyn 调控 M1 型巨噬细胞极化的具体机制尚未完全明确。基于此，本研究拟通过靶向调控 Lyn 活性，深入探究其在 M1 型巨噬细胞极化中的作用及机制，以期为慢性炎症性疾病的病理机制解析与治疗策略开发提供新的理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞和质粒人单核细胞系THP-1细胞系和人胚胎肾细胞HEK 293T细胞购自美国121典型培养物保藏中心（ATCC）。表达质粒和包装质粒及包膜质粒：质粒 lentiCas9-Blast（美国Addgene有限公司，货号：#52962）；pMD2.G 和 psPAX2 质粒均由本实验室保存。1.1.2主要试剂和仪器佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、100 mmol/L PMSF、RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物（All-in-one，100x）（北京索莱宝科技有限公司，货号：P6741、IL2020、P0100、R0010、K107680P）；Lyn、磷酸化Lyn激酶（phospho-Lyn，P-Lyn，Tyr507）、β-actin（美国Cell Signaling Technology公司，货号：#2796、#2731T、#4967）；磷酸化Janus 激酶1 （phospho-JAK1，P-JAK1）、JAK1（杭州臻优品生物科技有限公司，货号：YP-Ab-14315、YP-Ab-14225）；磷酸化STAT1（phospho-STAT1，P-STAT1），STAT1、抗原分化簇80（cluster of differentiation 80，CD80）（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：AP0135、A19563、A23729） ；RNAiso Easy、逆转录试剂、qPCR试剂（日本TAKARA公司，货号：TCH020、RR037A、RR820A）。酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：Infinite 200 PRO）；qPCR仪、梯度PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：QuantStudio 3、veriti Fast）；曝光仪（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：GenoSens 2000）；电泳仪（美国Bio-RAD公司，型号：PowerPacTM Basic Power Supply），流式细胞仪（美国BD公司，型号：AccuriTM C6 Plus）。1.2方法1.2.1敲除Lyn质粒载体构建根据NCBI数据库中人Lyn基因编码序列［Gene ID：4067，转录本：Lyn-202，ENST 00000519728.6借助于在线设计平台（https：//chopchop.cbu.uib.no/）］，遵循CRISPR/Cas9的靶向设计准则，本研究成功构建了特异性作用于Lyn基因的sgRNA序列，并进而获得了其相应的反义互补序列。使用BsmBI-V2酶酶切LentiCRISPR-V2质粒，将得到酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。酶切成功进行胶回收，将Lyn-sgRNA进行退火，在退火过程中形成的双链DNA片段与经BsmBI核酸内切酶（BsmBΙ restriction enzyme，BsmBΙ）切割并产生特定黏性末端的质粒载体进行互补配对，并用T4 DNA连接酶进行连接，连接成功即为Lenti-Lyn-gRNA载体，将连接成功的载体进行测序，用作后续构建THP-1单克隆细胞株的质粒载体。1.2.2慢病毒包装及感染THP-1细胞按照包装体系：目的质粒、包装质粒以及包膜质粒的比例被设定为4∶3∶1，在1.5 mL EP管内静置5 min 后，将含有包装体系的溶液与PEI进行混合并施以涡旋操作，随后于室温条件下进一步静置 30 min。随后将质粒混合液加入HEK293T细胞中进行培养，12 h后换液，48 h和72 h收集上清液，将收集的病毒上清液5 560 r/min离心15 min，将获得的病毒沉淀分装，于-80 ℃保存。病毒体积按照 0、2、5、10、15 μL的量加入接种有THP-1细胞的6孔板中，再加入2 μL 1 μL/mL的聚凝胺，加完后用封口膜包板，用台式冷冻离心机于37 ℃、3 000 r/min 离心1 h，离心完成后正常培养，于12 h后去除含有病毒的培养基，并替换为全新的完全培养基。1.2.3Lyn-/-单克隆细胞株的构建将1.2.2项中获得的细胞进行Western blot检测，初步鉴定Lyn的敲低情况。扩增培养敲低效果最好的细胞，将细胞进行计数，采用极限稀释法，即取200个细胞制备细胞悬液（100 μL培养基中含有一个细胞），取100 μL每孔接种于96孔板中培养扩增，Western blot检测Lyn敲除情况。1.2.4M0及M1巨噬细胞分化将处于对数期生长的野生型THP-1细胞（LynWT）按照3×106个/孔接种于6孔板，将100 ng/mL的PMA稀释液加入到6孔板中，培养48 h分化为M0巨噬细胞。将100 ng/mL的LPS稀释液加入到M0细胞中，培养0、4、6、8 h，分化为M1巨噬细胞。1.2.5RNA提取和qPCR检测使用RNAiso Easy试剂提取LynWT、Lyn-/-、LynWT-M1、Lyn-/--M1的总细胞RNA。qPCR是使用Applied biosystems by Thermo Fisher Scientific（QuantStudio 3），在QuantStudio 3实时PCR机器中完成。使用Applied biosystems by Thermo Fisher Scientific Veriti逆转录机器进行逆转录。使用两步法进行逆转录，条件是，第1步：42 ℃、2 min；第2步：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。反转录结束后，按照TAKARA（RR820A）说明书配制qPCR反应体系，反应条件：95 ℃、30 s，90 ℃、5 s，60 ℃、30 s，进行40个循环；使用QuantStudioTM 3 System软件对PCR产物进行熔融分析。实时PCR引物合成序列见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.T001表1引物序列Tab. 1Primer sequencesGeneForward （5′⁃3′）Reverse （5′⁃3′）LynTGCAGACCCTGAGCCCACTATTCCTTCCACTGCCCACTCCβ⁃actinCATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGATiNOSGCTCTACACCTCCAATGTGACCCTGCCGAGATTTGAGCCTCATGIL⁃6AGACAGCCACTCACCTCTTCAGTTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTGCXCL⁃10GGTGAGAAGAGATGTCTGAATCCGTCCATCCTTGGAAGCACTGCACD11bGCCTTGACCTTATGTCATGGGCCTGTGCTGTAGTCGCACTCD68GGAAATGCCACGGTTCATCCATGGGGTTCAGTACAGAGATGCCD14ACGCCAGAACCTTGTGAGCGCATGGATCTCCACCTCTACTG1.2.6流式细胞术分析将分化时间为0、4、6、8 h的M1巨噬细胞消化2 115 r/min离心4 min收集细胞，将收集的细胞用1 mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬，2 115 r/min离心3 min，去上清液，重复2次，用0.5%的BSA/PBS重悬细胞，每管100 μL。为了检测CD80在M1巨噬细胞表面的表达，每管加入0.2 μg/mL的CD80一抗稀释液（稀释比1∶1 000）5 μL。振荡混匀，室温避光孵育20 min。2 115 r/min离心5 min去上清液，0.5% BSA/PBS溶液洗涤1次。200 μL甲醛固定15 min，0.5%的BSA/PBS溶液2 115 r/min 离心5 min洗涤1次，400 μL 0.5%的BSA/PBS重悬细胞，然后通过流式细胞仪分析细胞。使用FlowJo软件分析数据。1.2.7Western blot实验从M1巨噬细胞及THP-1细胞中提取总蛋白，并添加了RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制剂=100∶1∶1的混合溶液100 μL。蛋白质浓度通过BCA法来确定。蛋白质通过SDS/PAGE蛋白电泳，转移到聚偏二氟化物（PVDF）膜上，并用5%的脱脂牛奶洗脱［12］。将PVDF膜与0.2 μg/mL一抗Lyn、总JAK1、P-JAK1、总STAT1、P-STAT1（均1∶1 000）与0.05 μg/mL β-actin抗体（1∶5 000）共同放于4 ℃孵育过夜。洗膜，采用0.05 μg/mL的辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG和抗鼠IgG用作二抗（稀释比1∶5 000），室温孵育2 h，用显色液显色，进行曝光检测。用ImageJ进行灰度分析条带灰度值确定蛋白表达情况。1.3统计学处理本研究均进行了3次独立重复实验，所得数据均以（x¯±s）的形式呈现。使用GraphPad Prism 8.0软件对所收集的数据进行统计检验，组间两两均值比较使用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用Sidak检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1成功构建Lyn-/-单克隆细胞酶切质粒的琼脂糖凝胶电泳结果显示已将LentiCRISPR-V2质粒酶切为两个片段，即12 000 bp和2 000 bp（图1A）。Lenti-Lyn-sgRNA质粒公司测序显示，Lenti-Lyn-sgRNA质粒测序结果与空白LentiCRISPR-V2质粒结果比对产生了5处碱基错配，证明产生突变，Lyn-sgRNA已经成功连接到LentiCRISPR-V2质粒上（图1B）。慢病毒感染THP-1 野生型细胞Western blot检测结果显示，加入慢病毒后敲低了THP-1细胞中的Lyn，加入5 μL和10 μL慢病毒感染的混合克隆稳定株的Lyn敲低效率更明显（图1C）。选取5 μL病毒感染的混合细胞进行单克隆筛选，Western blot条带图显示Lyn-/-细胞中没有Lyn表达，LynWT与Lyn-/-细胞中Lyn的表达量差异有统计学意义（t=91.30，P0.000 1）（图1D），由此已成功构建完全敲除Lyn的单克隆细胞（Lyn-/-），将得到的单克隆细胞进行培养扩增，用于进行后续实验。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F001图1Lenti-Lyn载体构建及Lyn-/-单克隆筛选Fig.1Construction of Lenti-Lyn vector and screening of Lyn-/- monoclonalA： BsmBI-V2 digestion of LentiCRISPR-V2 plasmid， characterized by 1.5% agarose gel electrophoresis； B： Sequencing of Lyn-gRNA recombinant plasmid； C： Lyn protein levels in stable cell lines obtained via monoclonal selection with different viral concentrations； D： Lyn protein expression levels in Lyn⁻/⁻ stable cell lines obtained via monoclonal selection after infection with 5 μL of virus； ****P 0.000 1 vs LynWT .2.2M0巨噬细胞分化成功M0巨噬细胞表达多种巨噬细胞相关的特征性表面标志物，如CD68、CD14、CD11b和CD45。本实验通过qPCR检测THP-1分化为M0巨噬细胞后CD11b、CD68和CD14的mRNA表达水平，来判断M0巨噬细胞的分化（图2）。结果显示，无论是LynWT还是Lyn-/-，利用PMA诱导后，CD11b（t=76.53、23.48，均P0.000 1）、CD68（t=24.05、13.00，均P0.001）、CD14（t=7.40、44.09，均P0.01）表达量均明显升高，表明LynWT-M0及Lyn-/--M0巨噬细胞均已分化成功。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F002图2qPCR检测M0巨噬细胞标志物CD11b、CD68、CD14表达Fig. 2qPCR was performed to detect the expression of M0 macrophage markers CD11b， CD68 and CD14a：LynWT； b：LynWT-M0； c：Lyn-/-； d：Lyn-/--M0； **P0.01， ****P0.000 1 vs LynWT； ###P0.001， ####P0.000 1 vs Lyn-/-.2.3Lyn参与M1巨噬细胞极化qPCR检测Lyn的mRNA表达结果显示（图3A），细胞分化为M1巨噬细胞后Lyn的mRNA表达升高，Western blot检测结果显示细胞分化为M1巨噬细胞后Lyn的蛋白表达升高（t=149.9，P0.000 1）、P-Lyn蛋白表达升高（t=4.563，P0.05）（图3B），证明Lyn 参与了 M1 巨噬细胞极化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F003图3qPCR和Western blot 检测M1 巨噬细胞极化Lyn和P-Lyn的表达Fig. 3Detection of Lyn and P-Lyn expression during M1 macrophage polarization by qPCR and Western blot analysisA： Detection of Lyn expression during M1 polarization of LynWT macrophages by qPCR analysis； B： Detection of Lyn and P-Lyn expression during M1 polarization of LynWT macrophages by Western blot analysis； *P0.05， ****P0.000 1 vs LynWT.2.4Lyn影响M1巨噬细胞的细胞表型qPCR检测Lyn敲除对M1巨噬细胞iNOS、IL⁃6和CXCL⁃10 mRNA表达的影响，结果显示，敲除Lyn后THP-1细胞向M1巨噬细胞分化的不同时间内iNOS（t=11.820、1.635、3.581，5.378，P0.001，P0.05，P0.01，P0.001）、IL⁃6（t=3.264、56.340、41.550、19.300，均P0.05）和CXCL⁃10（t=125.200、4.974、9.409、11.310，均P0.001）的分泌减少（图4A-4C）。LynWT与Lyn-/-细胞在0 h时Lyn-/-细胞的IL⁃6（t=3.264， P0.05）明显变少，表明敲除Lyn后抑制了M0细胞IL⁃6的分泌，同时也抑制了M1细胞分泌iNOS、IL⁃6和CXCL⁃10。这些结果显示，Lyn参与了M1巨噬细胞的极化过程，敲除Lyn之后抑制了THP-1向M1巨噬细胞的分化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F004图4Lyn影响M1巨噬细胞的细胞表型Fig.4Lyn modulated the cellular phenotype of M1 macrophagesA-C： iNOS， IL⁃6， CXCL⁃10 mRNA expression in Lyn⁻/⁻-M1 macrophages at 0， 4， 6， and 8 hours； D： iNOS protein expression in Lyn⁻/⁻ cells at 0， 4， 6， and 8 hours during M1 macrophage polarization； E： Detection of CD80 expression in Lyn⁻/⁻ cells at 0， 4， 6， and 8 hours during M1 macrophage polarization via flow cytometry； *P0.05， **P0.01， ***P0.001， ****P0.000 1 vs LynWT-M1.Western blot检测iNOS的蛋白表达结果显示（图4D），向M1巨噬细胞极化4 h和8 h （t=4.141、4.962， 均P0.01）Lyn-/--M1组iNOS蛋白水平下降 ，但是向M1巨噬细胞极化0 h和6 h的iNOS蛋白水平没有显著变化，证明Lyn敲除后会抑制M1巨噬细胞分泌iNOS，结果也同时证明了Lyn敲除后会抑制THP-1细胞向M1巨噬细胞的分化。流式细胞术结果显示（图4E），相对于LynWT M1巨噬细胞，Lyn-/- M1巨噬细胞8 h时细胞表面标志物CD80的表达降低 （t=3.31，P0.05）。2.5Lyn 基因敲除对 M1 巨噬细胞极化能力存在明显影响JAK/STAT信号通路在巨噬细胞分化过程发挥着关键作用。本研究Western blot检测结果显示，随着分化时间的延长，Lyn-/--M1巨噬细胞JAK1蛋白表达逐渐下降（F趋势=180.02，P0.000 1），而P-JAK1的表达没有显著变化（图5A）。同时，Lyn-/--M1巨噬细胞JAK1下游P-STAT1/STAT1表达量在4、6、8 h也明显下降（图5B）（t= 4.137、4.454、4.206，均P0.01）。这些Western blot结果说明敲除Lyn明显抑制了THP-1向 M1 巨噬细胞的极化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.02.001.F005图5Lyn-/-抑制JAK1/STAT1信号通路Fig. 5Inhibition of the JAK1/STAT1 signaling pathway via Lyn-/-A， B： The effects of Lyn⁻/⁻ on the protein levels of P-JAK1/JAK1 and P-STAT1， detected by Western blot analysis； *P0.05， **P0.01， ***P0.001， ****P0.000 1 vs LynWT-M1.3讨论慢性炎症是由感染、组织损伤、自身免疫病等因素引发的长期持续性炎症反应［13］，其特征为炎症细胞（如巨噬细胞、T细胞）的持续浸润、促炎与抗炎因子失衡及组织纤维化［14–15］。慢性炎症主要表现为M1巨噬细胞持续分泌炎症因子［16–17］，以及依赖于单核细胞向炎症部位的迁移和浸润及单核细胞与内皮细胞的黏附。巨噬细胞作为慢性炎症病灶中的主要免疫细胞［14］，其极化状态直接影响炎症的转归。M1极化主导促炎阶段［15–17］，若未能及时向M2型转换，可导致炎症慢性化，引发类风湿关节炎［18］、动脉粥样硬化等疾病。因此，调控巨噬细胞极化有望成为慢性炎症治疗和缓解的有效方式。在巨噬细胞中，Lyn的表达水平与细胞活化状态相关，其通过磷酸化下游信号分子调控细胞增殖、分化和炎症反应。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功地敲除了Lyn，得到了敲除Lyn的THP-1细胞系。对敲除Lyn后的THP-1-M1巨噬细胞的表型变化和机制进行了深入研究，结果显示Lyn在M1巨噬细胞分化过程中起正向促进作用，敲除Lyn后 THP-1-M1型巨噬细胞iNOS、IL-6、CXCL-10和CD80等M1巨噬细胞标志物及炎症的分泌受到抑制，以上的细胞表型实验证明敲除Lyn后抑制了THP-1-M0巨噬细胞向M1巨噬细胞的极化。研究显示［19］，JAK/STAT信号通路与M1巨噬细胞极化有关。本研究检测结果显示，随着分化时间的延长，敲除Lyn后M1巨噬细胞JAK1的蛋白表达逐渐下降，而P-JAK1的表达没有显著变化；同时，JAK1下游P-STAT1/STAT1 表达量也明显下降。提示敲除Lyn后，JAK1的抑制作用导致其下游分子P-STAT-1的水平下降，这可能进一步导致了iNOS、IL-6、CXCL-10和CD80等M1巨噬细胞标志物的分泌减少，最终实现对M1巨噬细胞极化的抑制。M1型巨噬细胞过度活化是类风湿关节炎、银屑病等慢性炎症的核心病理基础，靶向该新型激酶可特异性抑制M1极化相关促炎因子IL-6的释放，降低炎症损伤；同时，在肿瘤微环境中，M1型巨噬细胞具有抗肿瘤免疫活性，通过激活该激酶增强M1极化可提升免疫检查点抑制剂疗效，为肿瘤免疫联合治疗提供新思路［20］。在自身免疫病治疗研究中，Lyn 抑制剂可通过调控托样受体（TLR）信号通路的负反馈机制，对巨噬细胞M1极化过度激活“适度刹车”，临床前试验表明，其能显著减轻胶原诱导性关节炎模型的关节肿胀，抑制滑膜组织中 IL-1β、IL-18的过度分泌，疗效优于传统JAK抑制剂且无明显骨髓抑制副作用［21］。 本研究通过 CRISPR/Cas9敲除Lyn后，M1巨噬细胞JAK/STAT通路关键分子JAK1、P-STAT1 表达显著下调，iNOS、IL-6、CXCL-10 及 CD80 的表达亦受到明显抑制。推测Lyn 敲除或通过靶向调控JAK1/P-STAT1介导的 JAK/STAT 通路发挥作用。本研究揭示了Lck/Yes相关新型酪氨酸激酶对巨噬细胞M1极化的调控机制，填补了 Src 家族激酶在固有免疫细胞功能调控中的研究空白。同时，为慢性炎症性疾病和肿瘤的干预提供了新靶点。然而，本研究也存在着一些局限性。一是仅采用细胞模型，其简化特性限制结论适用性，后续需动物实验验证；二是Lyn功能多样且相互交织，难以精准解析其在慢性疾病中的特定机制。未来研究需综合考量上述因素，优化研究方法与技术，以全面揭示Lyn在慢性疾病中的作用机制，为疾病防治提供理论支撑。