在全球范围内，肺癌仍然是最常见的癌症之一，据估计2022年约有250万新发（12.4 %）和180万死亡肺癌病例（18.7%）［1］。组织学上，肺癌主要分为小细胞癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）两种类型，其中NSCLC约占所有肺癌类型的85%。NSCLC由多种组织学亚型组成，包括肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鳞状癌和大细胞肺癌，其中LUAD占比40%左右［2–3］。近几十年来，手术、放疗、靶向治疗和免疫治疗等多种治疗方案取得了重大进展，但LUAD患者的5年总生存率仍不到20%［4］。DHCR7是一种催化7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol reductase，7-DHC）转化为胆固醇的关键酶，参与胆固醇合成的最后一步［5］，而胆固醇可以促进肿瘤进展，抑制抗肿瘤免疫应答［6］。有研究［7］表明，DHCR7促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。然而，DHCR7是否影响LUAD的发生发展目前并不清楚。因此，该研究旨在探究DHCR7在LUAD中的表达，并通过体外实验分析DHCR7对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭作用及其信号分子机制，为临床治疗LUAD寻找新的靶点。1材料与方法1.1数据来源通过Kaplan-Meier（https：//kmplot.com/analysis/index）数据库基于高通量基因表达数据库（gene expression omnibu，GEO）、基因型-组织表达数据库（genotype-tissue expression，GTex）、癌症基因组图谱数据库（the cancer genome atlas，TCGA）和综合性癌症基因组数据库（therapeutically applicable research to generate effectivetreatments，TARGET）公开数据分析DHCR7在LUAD中mRNA表达情况；并通过Kaplan-Meier数据库分析LUAD中DHCR7的预后意义。通过HPA（https：//www.proteinatlas.org/）数据库获得DHCR7免疫组化图谱。1.2主要材料A549细胞系购自上海富衡生物技术有限公司；H1299细胞系购自北京沃比森科技有限公司；胎牛血清（货号：BC-SE-FBS07）、RPMI-1640培养基（货号：BC-M-017）、DMEM培养基（货号：BC-M-005）、1%青-链霉素（货号：BC-CE-007）和0.25%胰酶消化液（货号：BC-CE-003）购自南京生航生物技术有限公司；Jet Prime转染试剂（货号：10100001）购自德国Sartorious公司；RIPA裂解液（货号：P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol提取试剂（货号：B511311-0100）、DHCR7抗体（货号：D122232）、si-RNA和PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；GAPDH抗体（货号：AF7021）购自美国Affinity公司；CCK-8试剂盒（货号BMU 106）、ECL发光液（货号：BMU 102）购自武汉亚科因生物技术有限公司。1.3主要仪器CO2细胞培养箱（型号：HF90/HF240）购自上海力申科学仪器有限公司；PCR仪器（型号：A 33185）购自美国Thermo公司；酶标仪（型号：ST 960）购自济南爱来宝仪器设备公司，Western blot显影仪（型号：JS-1070P EV）购自上海天能科技有限公司。1.4方法1.4.1细胞培养细胞培养于37 ℃、5% CO2的培养箱中，配制含10%的胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM和RPMI-1640培养基，待细胞密度长至90%左右时，使用胰酶进行消化传代。1.4.2细胞转染可传代细胞经过胰酶消化后，离心，铺于6孔板中。等6孔板细胞密度达到70%左右，更换2 mL完全培养基，按照Jet Prime转染试剂说明书将si-control、si-DHCR7（序列见表1）转入细胞中。置于培养箱中孵育，转染24、48 h后进行后续实验。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.T001表1DHCR7的干扰序列Tab.1Interference sequences of DHCR7NameInterference sequences （5′-3′）si-controlsense： UUCUCCGAACGUGUCACGUTTantisense： ACGUGACACGUUCGGAGAATTsi-DHCR7-1sense： UGACAGAACCGCAUCUCAATTantisense： UUGAGAUGCGGUUCUGUCATTsi-DHCR7-2sense： ACACGUCUCUCCCUGACUUTTantisense： AAGUCAGGGAGAGACGUGUTT1.4.3RT-qPCR用TRIzol试剂说明书从细胞中提取总RNA，将其逆转录成cDNA。随后，使用SYBR Green荧光染料法，按照试剂盒说明书，进行PCR反应（引物序列见表2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.T002表2PCR引物序列Tab.2PCR primer sequencesNamePrimer sequences（5′-3′）GAPDHF： CAGGAGGCATTGCTGATGATR： GAAGGCTGGGGCTCATTTDHCR7F： GCTGCAAAATCGCAACCCAAR： GCTCGCCAGTGAAAACCAGT1.4.4Western blot细胞密度达到80% ~ 90%时，使用含有PMSF∶RIPA = 1∶100的裂解液在冰上裂解细胞提取总蛋白，蛋白定量使用BCA法进行，然后使用SDS上样缓冲液稀释配制蛋白上样。配制凝胶，等量蛋白上样，电泳进行蛋白分离。电泳结束后将蛋白转移到已预先被甲醇激活的PVDF膜上，随后使用蛋白封闭液封闭1 h。封闭后，TBST洗膜3次，每次10 min。随后将条带与DHCR7（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体置于4 ℃冰箱过夜。次日，将蛋白条带取出，TBST洗膜3次，置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）中，室温孵育1 h。随后TBST洗膜3次，置于显影仪中显影，进行曝光。1.4.5CCK-8检测细胞活性将LUAD细胞分为si-DHCR7组和si-Control组，种植于96孔板中，每孔5 000个。每组设置6个复孔，培养24、48、72、96 h。在每个时间点，按照CCK-8∶基础培养基 = 1∶10配制CCK-8显色液，每孔总体积为110 μL，置于细胞培养箱中培养1 h。酶标仪测定96孔板450 nm波长处吸光度（absorbance， A）。1.4.6划痕实验检测细胞迁移能力将LUAD细胞分为si-DHCR7组和si-Control组，6孔板后用记号笔划3道横线，细胞胰酶消化后铺于6孔板中，当细胞密度达到90%以上时，使用200 μL的枪头，垂直于6孔板底部横线，适当力度竖直划1条直线，用PBS清洗2 ~ 3次，去除脱落细胞，接着更换成无血清培养基，在0、24、48 h对划痕区域进行拍照并记录。1.4.7Transwell实验检测细胞侵袭能力用无血清培养基饥饿处理细胞，第二天检查每个小室没有漏液后，加入60 μL的无血清培养基稀释的基质胶于小室中，置于培养箱孵育。4 h后，洗去多余液体，将细胞消化、离心，无血清培养基重悬，计数每个小室细胞数为1×10 5个，体积为150 μL的细胞悬液加入上室中，24孔板中加入600 μL 30%血清的完全培养基，细胞培养箱中孵育48 h后，将小室取出，吸去小室中剩余液体，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定30 min后，使用结晶紫染液染色15 min，PBS清洗2 ~ 3次，用倒置显微镜观察和拍照记录。1.4.8细胞克隆实验LUAD细胞分为si-DHCR7组和si-Control组，消化离心后，接种于6孔板中，每孔2 000个细胞，使用完全培养基培养7 ~ 10 d。显微镜下观察到长出大于50单细胞克隆，并且克隆间还未出现相连时，弃去培养基，PBS清洗，使用4%多聚甲醛固定30 min后，吸去甲醛，结晶紫染液染色15 min，PBS冲洗3次，放于通风处晾干，拍照记录结果。1.5统计学处理使用GraphPad Prism 9.5软件对数据进行分析与作图，ImageJ软件进行数据量化分析，实验数据以x¯±s表示。两组数据之间比较采用t检验。多组数据之间用单因素方差分析。P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1DHCR7在LUAD中的表达和预后分析从Kaplan-Meier数据库中获得LUAD的GEO、GTex、TCGA和TARGET公开数据，数据分析显示与正常肺组织相比，DHCR7 mRNA在LUAD中的表达水平明显上调（P0.001），见图1A。后续从HPA数据库获得LUAD和正常肺组织的免疫组化图谱，进一步分析验证了DHCR7蛋白在LUAD中的高表达（图1B）。Kaplan-Meier数据库对临床患者数据进行比较分析（图1C），结果显示，DHCR7表达水平与LUAD患者总生存期（overall survival，OS）呈明显负相关（P0.001）。Western blot结果表明与BEAS-2B细胞相比，H1299和A549细胞中DHCR7的蛋白表达水平更高，差异有统计学意义（P 0.05，P 0.01），见图1D。以上结果表明DHCR7在LUAD中高表达，且与预后不良有关。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.F001图1DHCR7在LUAD中的表达和预后分析Fig. 1Expression and prognostic analysis of DHCR7 in LUADA：The expression of DHCR7 mRNA in normal tissues and lung adenocarcinoma was compared and analyzed using the Kaplan-Meier database；B： Immunohistochemical images of DHCR7 expression in normal lung tissue and lung adenocarcinoma obtained from the HPA database ×200；C：Kaplan-Meier database analyzed the survival curves of DHCR7 expression in patients with lung adenocarcinoma；D：Western blot detection of protein expression in BEAS-2B， H1299， and A549；*P0.05， **P0.01 vs BEAS-2B group.2.2敲低DHCR7抑制LUAD细胞的增殖能力RT-PCR（图2A）和Western blot（图2B）结果表明，相较于si-control细胞，si-DHCR7 H1299和A549细胞DHCR7 mRNA（F=538.1， P0.000 1；F=964.4， P0.000 1）和蛋白（t=2.925， P0.05；t=3.020， P0.05）的表达水平均显著下降，提示si-RNA达到预期效果。细胞克隆形成实验表明，与si-control组相比，si-DHCR7组H1299和A549细胞克隆形成数显著减少（t= 19.38， P0.000 1；t=12.28， P0.001），见图2C、2D。CCK-8实验进一步证明，敲低DHCR7后，H1299（t=4.798、12.190、18.960、11.520， P0.000 1）和A549（t=4.333、 6.287、6.508、10.130， P0.000 1）细胞的增殖能力明显减弱，见图2E。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.F002图2敲低DHCR7抑制LUAD细胞的增殖能力Fig. 2The knockdown of DHCR7 inhibited the proliferative capacity of LUAD cellsA：RT-PCR was used to verify the knockdown efficiency of si-DHCR7 in H1299 and A549 cells；B： Western blot was used to verify the knockdown efficiency of si-DHCR7 in H1299 and A549 cells；C，D： Assessing the impact of DHCR7 knockdown on the clonogenic potential of H1299 and A549 cells through cell cloning experiments；E： The effects of DHCR7 knockdown on the proliferation activity of H1299 and A549 cells was evaluated by CCK-8 assay；*P0.05，***P0.001，****P0.000 1 vs si-control group.2.3敲低DHCR7抑制LUAD细胞的迁移能力细胞划痕实验显示，与si-control相比，si-DHCR7组H1299细胞24 h（t=6.978，P0.001）和48 h（t=9.365，P0.000 1）迁移能力明显下降；同样si-DHCR7 A549细胞24 h（t=8.827，P0.000 1）和48 h（t=6.940，P0.001）细胞的迁移能力亦显著下降，差异有统计学意义。见图3。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.F003图3敲低DHCR7抑制LUAD细胞的迁移能力 ×4Fig. 3The knockdown of DHCR7 inhibited the migratory capacity of LUAD cells ×4***P0.001， ****P0.000 1 vs si-control group.2.4敲低DHCR7抑制LUAD细胞的侵袭能力Transwell实验显示，与si-control组相比，si-DHCR7 H1299细胞（t=7.963， P0.01）和A549（t=8.883， P0.001）细胞的侵袭能力均显著减弱，提示敲低DHCR7抑制LUAD的侵袭能力。见图4。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.F004图4敲低DHCR7抑制LUAD细胞的侵袭能力 ×10Fig. 4The knockdown of DHCR7 inhibited the invasive ability of LUAD cells ×10**P0.01， ***P0.001 vs si-control group.2.5敲低DHCR7后抑制ERK磷酸化水平采用Western blot分析磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway，MAPK/ERK）和Janus激酶/信号转导及转录激活因子3（janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3，JAK/STAT3）信号通路中关键信号分子AKT、ERK和STAT3的磷酸化水平。图5显示，与si-control H1299和A549细胞相比，si-DHCR7组H1299和A549细胞的p-ERK显著被抑制（t=12.86，P0.000 1；t=3.909， P0.01），而PI3K/AKT与JAK/STAT3信号通路中的AKT和STAT3信号磷酸化水平未显著下调，提示DHCR7在LUAD中可能通过激活MAPK/ERK信号通路发挥促肿瘤作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.004.F005图5敲低DHCR7后抑制ERK磷酸化水平Fig.5The knockdown of DHCR7 suppressed the phosphorylation levels of ERK**P0.01， ****P0.000 1 vs si-control group.3讨论本研究生信部分分析表明，DHCR7 mRNA和蛋白在LUAD中的表达水平均显著高于癌旁组织。并且，DHCR7表达水平越高，患者OS越低，本研究结果揭示DHCR7在LUAD中的促肿瘤作用。已有研究［8］表明，DHCR7在宫颈癌中显著高表达，与宫颈癌患者低生存率显著相关。在膀胱癌中的研究［9］也表明，DHCR7表达水平与膀胱癌分级和分期相关，是膀胱癌的独立危险因素，与患者预后不良有关。本研究结果与这些研究一致，提示DHCR7是LUAD的多种肿瘤的促癌因子，与肿瘤进展和预后息息相关，是LUAD治疗的一个潜在靶标。本研究通过克隆形成实验、CCK-8、细胞划痕以及Transwell实验表明，DHCR7促进LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。在生物学功能上，DHCR7是一种参与胆固醇合成过程的限速酶，提示DHCR7的促癌作用机制可能与胆固醇合成有关。肿瘤细胞中DHCR7显著增加，重新编程胆固醇代谢，导致肿瘤细胞中胆固醇水平高于正常组织细胞［10–11］。肿瘤细胞内高胆固醇可分泌到肿瘤微环境中，并且，肿瘤间质细胞的DHCR7表达也显著增高，通过促进胆固醇外排导致肿瘤微环境胆固醇进一步积累，进而诱导CD8+ T细胞耗竭，最终促进肿瘤侵袭和转移［12］。最近有文献［6］报道，抑制肿瘤细胞胆固醇摄取或生物合成途径，可以有效抑制肺癌生长。这些机制方面的研究都为本实验关于DHCR7在LUAD中的促肿瘤作用提供了坚实的理论基础。本研究与DHCR7在其他瘤种的实验结果一致，例如，DHCR7可通过调控胆固醇生物合成进而促进胃癌细胞［10］和胰腺癌［11］的增殖、迁移和侵袭。此外，体内外实验［13］表明，在膀胱癌中，敲低DHCR7可以减少膀胱癌细胞在体外的侵袭和体内转移。这些结果提示DHCR7通过促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力促进LUAD的发展，其机制可能与胆固醇代谢有关，后续还需实验验证DHCR7介导的胆固醇升高在LUAD中的促癌作用。为进一步阐明DHCR7在LUAD中发挥作用的信号分子机制，本研究通过Western blot实验，比较si-control和si-DHCR7 H1299和A549细胞的PI3K/AKT、JAK/STAT3、MAPK/ERK 3种经典信号通路中关键信号分子磷酸化水平。结果显示敲低DHCR7后，p-ERK水平显著降低，但是p-AKT和p-STAT3水平没有显著下调。文献［14］表明，DHCR7通过影响胆固醇代谢，导致KN基序和锚蛋白重复结构域4分子（KANK4）表达上调，进而激活PI3K/AKT信号通路，促进宫颈癌细胞上皮间质转化（EMT）、迁移和侵袭。也有研究［9］表明，DHCR7可通过激活膀胱癌中的PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肿瘤发生。上述结果表明，DHCR7在不同的肿瘤类别中可以通过调控不同的关键信号通路促进肿瘤的发生发展。MAPK/ERK信号通路是生理和病理状态下的重要调节通路，在细胞增殖、分化和迁移等细胞功能中发挥重要的调节作用［15］。ERK信号被激活后，p-ERK转位至细胞核内，通过直接磷酸化各种核蛋白如骨髓细胞瘤癌基因（c-MYC）、JUN原癌基因（c-JUN）和激活转录因子2（ATF2）等来调控基因表达［16–17］，与LUAD肿瘤进展密切相关［18］。本研究表明DHCR7通过MAPK/ERK信号通路参与了LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭，但DHCR7如何精确调控ERK的磷酸化有待于进一步研究。综上所述，本研究证实DHCR7在LUAD中表达显著上调，与LUAD患者预后不良有关。在LUAD中，DHCR7能够促进细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与ERK信号有关，提示DHCR7可能作为LUAD患者诊断和治疗的潜在分子标志物。