先天性双侧输精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens， CBAVD）是导致梗阻性无精子症（obstructive azoospermia， OA）的主要原因之一，作为囊性纤维化（cystic fibrosis， CF）的孤立性生殖系统表型 ［1］，其发生发展与囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR）基因的突变存在密切关联［2］，且存在显著种族差异：高加索人群CFTR突变检出率高，而以汉族为代表的亚洲人群突变检出率低、突变类型独特［2–3］，仍有部分CBAVD患者未检测到明确的CFTR突变［4］，提示非CFTR基因及环境因素参与疾病发生［5］。目前已有研究证实ADGRG2［4］等非CFTR基因与CBAVD相关，内皮素A型受体基因（endothelin receptor type A gene， EDNRA）作为CF相关易感基因，其多态性与欧洲、印度人群CBAVD发病相关［5–6］，且可调控细胞增殖、炎症反应等生理过程［7］，但其与汉族男性CBAVD的关联尚未明确。鉴于汉族CBAVD患者存在独特的遗传背景 ［2–3］，该研究通过分析EDNRA基因rs5335、rs1801708位点的基因型及单倍型与汉族男性CBAVD的关联性，探讨该基因在汉族人群CBAVD中的遗传作用，为亚洲人群CBAVD的遗传机制研究提供新证据，探索潜在的遗传筛查标记。1材料与方法1.1病例资料2009年7月— 2012 年1月，于安徽医科大学第一附属医院、江苏省人民医院生殖医学中心共纳入 124 例汉族男性 CBAVD 患者及100例健康汉族男性对照。病例组由2名高年资男科医师根据体检、超声、精液常规等临床资料诊断。全部患者行染色体核型（46，XY），Y染色体微缺失均正常，排除单侧输精管缺如、输精管闭锁等其他生殖道畸形；无严重肝肾功能不全、自身免疫性疾病、染色体异常及明确的生殖系统外伤或手术史；每位参与者均已获得知情同意。每位患者均进行3次精液分析（体积2.0 mL），评估异常的精液参数。精液以1 500 r/min离心7 min，通过高倍显微镜进行分析，未捕获到精子。病例组通过经皮附睾精子抽吸术（percutaneous epididymal sperm aspiration， PESA）或睾丸精子抽吸术（testicular sperm aspiration，TESA），在附睾或睾丸中发现了大量精子。对照组由100名先前育有1个或更多孩子的正常精子症男性组成。所有研究流程均遵循《赫尔辛基宣言》相关伦理准则，研究方案经安徽医科大学伦理委员会审查并批准（审批编号：ECAMU2008035）。1.2实验方法使用QIAamp基因组DNA试剂盒（Qiagen，德国希尔德 Hilden）提取外周血基因组 DNA。将所有DNA样本的浓度标准化为25~30 ng/μL。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism， PCR - RFLP）分析和直接测序检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）rs5335（C + 70G）和 rs1801708（G - 231A）的基因型。使用 GENETOOL 软件（www.biotools.com）设计 rs5335 和 rs1801708 的 PCR扩增引物：5′-CAGCCATAAGGACAGCAT-3′（正向）和 5′-GCTGAATACAACACGCA-3′（反向）；5′-CGC TGGTCTGACGATTGT-3′（正向）和5′-CTTGGC TACCCTTGGCAT-3′（反向）。rs5335的PCR热循环条件为95 ℃预变性3 min，40个循环（95 ℃变性25 s、61 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s），最后72 ℃进行7 min的终延伸。PCR产物使用限制性内切酶Tsp45I（New England Biolabs公司，北京）在65 ℃下消化2 h，然后在4%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以鉴定C等位基因。Tsp45I基因型分为GG、CG和CC，在凝胶上分别显示为1条258 bp的片段以及164 bp和94 bp的两条片段。rs1801708的PCR热循环条件为95 ℃预变性3 min，40个循环（95 ℃变性35 s、59 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，最后在72 ℃进行7 min的延伸步骤。rs1801708的基因型分为AA、AG和GG 3种。1.3统计学处理统计分析使用在线SHEsis软件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）和SPSS软件（SPSS 25.0）进行。卡方分析用于比较CBAVD患者与对照组之间EDNRA等位基因和基因型频率的差异，验证对照组的Hardy-Weinberg平衡，以及计算临床非连续性变量。临床参数采用t检验和方差分析（ANOVA）进行计算。P0.05为差异有统计学意义；单倍型分析P值经Bonferroni校正，校正后的显著性阈值：α_corrected = 0.05 / 4 = 0.012 5。采用倾向性评分匹配校正混杂因素（所用软件：R包MatchIt）。2结果2.1临床数据及rs5335、rs1801708多态性位点在病例-对照组中关联性分析除了平均年龄［（29.85 ± 5.25） vs （33.23 ± 4.65）岁，P 0.01］及饮酒情况差异显著外，CBAVD患者与对照组在吸烟状况、吸烟年数、辐射暴露、化学品接触、体质量指数（body mass index， BMI）、右侧睾丸体积和左侧睾丸体积方面差异均无统计学意义。见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.T001表1纳入研究对象的临床基本资料 ［x¯±s，n（%）］Tab. 1Characteristics of the study population ［x¯±s，n（%）］Characteristiccontrols（n=100）CBAVD （n=124）Age（years）33.23±4.6529.85±5.25SmokingYes48 （48.00）57 （45.96）No52 （52.00）67 （54.04）Smoking years4.64±5.383.75±4.99RadiationYes4 （4.00）2 （1.61）No96 （96.00）122 （98.39）Alcohol drinkingYes40（40.00）9 （7.26）No60 （60.00）115 （92.74）ChemicalsYes2 （2.00）1 （0.81）No98 （98.00）123（99.19）BMI （kg/m2）24.13±3.1423.24±3.36Right testicle volume（mL）14.93±2.6515.41±3.09Left testicle volume （mL）14.84±2.7015.34±3.18本研究中两个SNPs的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P 0.05）；rs5335 位点的 GG、CG、CC 3种基因型及 G、C 等位基因频率，在两组间的分布差异均无统计学意义，rs1801708位点的基因型与等位基因频率分布趋势与之一致，组间比较差异无统计学意义。见表2。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.T002表2rs1801708 和 rs5335 多态性位点在 CBAVD 组和对照组的关联性分析Tab.2Association analysis between rs1801708， rs5335 and CBAVDParametersCBAVD （n=124）controls （n=100）χ² （df）P valueOR （95% CI）rs1801708AA25 （0.202）11 （0.110）3.624 7 （2）0.163 2-AG47 （0.379）45 （0.450）-GG52 （0.419）44 （0.440）-A97 （0.391）67 （0.335）1.503 0 （1）0.220 21.275 1 （0.864 2-1.881 4）G151 （0.609）133 （0.665）-rs5335CC26 （0.210）18 （0.180）0.400 3 （2）0.818 6-CG60 （0.484）52 （0.520）-GG38 （0.306）30 （0.300）-C112 （0.452）88 （0.440）0.060 4 （1）0.805 81.048 0 （0.720 4-1.524 7）G136 （0.548）112 （0.560）-2.2单倍体分析rs1801708和rs5335变体的两种显著单倍型与CBAVD高度相关（表3）。rs1801708-rs5335单倍型AG与CBAVD风险增加显著相关（P = 0.008 6），Bonferroni校正后结果单倍型AG 0.008 6 0.012 5，仍然显著。rs1801708-rs5335单倍型GG与CBAVD风险降低可能相关（P=0.038 5），但Bonferroni校正后单倍型GG 不显著。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.T003表3EDNRA基因单倍型分析及关联检验（Bonferroni校正后）Tab.3Haplotype analysis of EDNRA variants in the case-control studyHaplotypeCBAVD（freq）Controls （freq）OR （95%CI）OriginalP valueResult after Bonferroni correctionAC*54.07（0.218）49.46（0.247）0.849 （0.546-1.318）0.464 842not significant（0.012 5）AG*42.93（0.173）17.54（0.088）2.178 （1.207-3.929）0.008 558significant （0.012 5）GC*57.93（0.234）38.54（0.193）1.277 （0.807-2.019）0.295 190not significant（0.012 5）GG*93.07（0.375）94.46（0.472）0.671 （0.460-0.980）0.038 529not significant（0.012 5）The order of the haplotypes was rs1801708 and rs5335； *： The indicated haplotypes could be compared； The significance threshold after Bonferroni correction： α=0.05/4=0.012 5； Comparing the original P value with 0.012 5， the P value of haplotype A-G （0.008 558） was still significant （0.012 5）， while haplotype G-G was not significant.2.3病例-对照组PSM校正病例组和对照组基本资料中年龄、饮酒情况差异显著，故采用倾向性评分匹配（propensity score matching，PSM）校正混杂因素（所用软件：R包MatchIt），匹配后还剩148例，病例组和对照组各74例，所有基本资料的组间差异均不显著，具体结果如表4所示。基于匹配后数据的EDNRA单倍型分析结果显示，经Bonferroni校正后，AG单倍型显著，其余单倍型均不显著，具体结果见表5。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.T004表4纳入研究对象的临床基本资料（倾向性评分匹配校正混杂因素后） ［x¯±s，n（%）］Tab.4Clinical baseline data of included study subjects（after propensity score matching to correctconfounding factors） ［x¯±s，n（%）］CharacteristicCase（n=74）Control（n=74）P valueAge（years）30.85 ±6.2432.53 ±4.610.065Alcohol drinking0.265Yes9 （12.2）15 （20.3）No65 （87.8）59 （79.7）Smoking0.406Yes34 （45.9）29 （39.2）No40 （54.1）45 （60.8）Smoking years3.82 ±5.303.72 ±5.330.908Radiation0.405Yes2 （2.7）4 （5.4）No72 （97.3）70 （94.6）Chemicals0.560Yes1 （1.4）2 （2.7）No73 （98.6）72 （97.3）BMI （kg/m2）23.39 ±3.5223.73 ±3.290.542Left testicle volume（mL）15.38 ±2.9315.01 ±2.840.447Right testicle volume（mL）15.42 ±2.8615.14 ±2.740.54710.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.T005表5EDNRA单倍型分析（倾向性评分匹配校正混杂因素后）Tab.5EDNRA haplotype analysis （after correcting confounding factors by propensity score matching）HaplotypeFrequencyCBAVD vs ControlsCBAVD （freq）Controls （freq）OR （95%CI）P valueGG55.06（0.372）67.64（0.457）0.714 （0.448-1.137）0.156GC30.04（0.203）39.52（0.267）0.710 （0.413-1.222）0.217AC33.89（0.229）27.38（0.185）1.287 （0.728-2.274）0.386AG29.01（0.196）13.47（0.091）2.533 （1.259-5.098）0.0092.4荟萃分析通过PubMed及HighWire 等数据库检索EDNRA基因与 CBAVD 关联相关文献，检出土耳其人群EDNRA基因 rs5335多态性位点阳性基因型CC，在西班牙人群未发现阳性基因型。印度人群中 rs5335的CC 等位基因与对照组相比显著差异（P0.05）， rs1801708位点则均未发现阳性基因型。这项荟萃分析纳入了224例CBAVD患者和201例对照。对于rs5335基因型分布中的CC基因型与CG + GG基因型，合并比值比（odds ratio， OR）为1.91，95%置信区间（confidence interval， CI）为1.21～3.03；P=0.308，I²=16.6%（图1）。对于rs1801708基因型分布中的AA基因型与AG + GG基因型，OR为0.93，95% CI为0.27～3.16；P=0.099，I²=56.7%（图2）。荟萃分析显示，CC基因型是CBAVD的危险因素。rs1801708的AA基因型在CBAVD患者和对照之间不存在显著关联。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.F001图1rs5335（cc-cggg）Fig.1rs5335（cc-cggg）10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.018.F002图2rs1801708（aa-aggg）Fig.2rs1801708（aa-aggg）3讨论EDNRA的主要生物学作用涉及血管收缩、细胞增殖、细胞凋亡和CF表型，其介导的信号通路在多器官发育及疾病发生中发挥重要作用。功能分析显示，ET-A受体在肺泡上皮中的表达高于另一种主要的ET-1［8］受体ET-B［9］，而EDN1/EDNRA通路可通过多种机制调控细胞功能，如激活STAT3磷酸化促进肿瘤细胞增殖迁移［10］，还可能通过NLRP3介导的炎症通路影响大动脉粥样硬化性卒中易感性［11］。在CF相关研究中，欧洲和美国3个队列的证据表明，EDNRA基因rs5335多态性与CF患者肺功能密切相关，CC基因型与不良肺部表型关联，且有害C等位基因的EDNRA mRNA表达高于保护性G等位基因［12］，而抑制内皮素途径的药物可改善血管收缩，进一步证实内皮素通路与CF的密切关联［13］。在CBAVD遗传研究中，欧洲研究［5］显示rs5335的CC基因型可能是CBAVD形成风险的潜在标志物，但未发现rs1801708与TGF-ß1基因型分布存在关联；印度研究［6］也发现CBAVD患者中rs5335的CC基因型显著更普遍，推测修饰基因参与干扰输精管形成。种族遗传背景异质性是疾病关联基因谱差异的核心因素，本研究针对汉族男性群体的发现进一步印证了这一规律。与欧洲、印度相关研究相比，本研究样本量更大，但未发现rs5335、rs1801708两个SNP与CBAVD存在显著关联，推测结果不一致可能源于多方面因素：一是种族差异导致的基因型频率分布不同；二是EDNRA与CFTR基因可能存在协同作用，但CFTR在中国人群中的低频率分布增加了评估难度［14］；三是rs5335可能作为miRNA靶点影响欧洲男性CBAVD外显率，而汉族男性CBAVD患者EDNRA基因内可能存在其他miRNA靶点［15］；四是基因-环境相互作用的潜在影响。单倍型分析可检测单个SNP分析无法发现的潜在关联，本研究中，rs1801708-rs5335单倍型AG与CBAVD风险增加显著相关，单倍型GG可能具有潜在保护作用，该发现尚未在其他种族群体中报道。结合亚洲人群特有的生殖发育相关基因调控网络特征，如CFTR基因中5T、p.I556V等特异性突变的高频率［2–3］，这一结果不仅为汉族CBAVD的遗传病因提供了新视角，也提示EDNRA单倍型可能成为区分亚洲与其他种族CBAVD遗传特征的标志性位点，丰富了CF相关生殖畸形的种族特异性遗传机制理论。尽管本荟萃分析中，rs5335的CC基因型是CBAVD的危险因素，但仍需考虑一些局限性。在进一步的回顾性研究中，可能需要更多的病例对照数量。如果检测到更多单倍型，应在进一步分析中纳入单倍型信息。本研究存在一定局限性：未对病例组进行CFTR基因及ADGRG2等其他非经典致病基因筛查，可能引入混杂风险；样本量仍有扩大空间，且未纳入更多单倍型信息进行分析。后续研究需扩大样本量，联合CFTR基因测序，排除突变阳性病例后重复验证EDNRA单体型与CBAVD的关联，或通过分层分析明确其在CFTR突变阴性CBAVD患者中的病因学贡献，同时关注基因-环境相互作用的影响。作为首次针对中国男性人群开展的EDNRA基因与CBAVD关联研究，本研究填补了汉族人群相关研究空白，为后续探索CBAVD遗传机制提供了新方向。基于现有遗传和功能证据，EDNRA在CF和CBAVD表型中发挥重要作用，未来研究应聚焦汉族人群中EDNRA更多多态性与CBAVD的关联，采用全基因组关联分析、功能分析等先进策略，揭示其发病机制及与CFTR、ADGRG2等基因的协同作用，为临床基因检测及子代患病风险评估提供指导。