金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）（简称“金葡菌”）是临床常见的致命性病原体［1］，可引发从皮肤软组织感染到菌血症、感染性心内膜炎等严重疾病。近年来，其对多类抗生素的耐药性显著上升，已成为威胁公共卫生的关键难题，而源自传统医学与日常膳食资源的天然产物，因其总体安全性较好、具有多通路调控潜力而受到关注。生姜作为常见食材与药用资源，富含多种活性成分［2］，其中姜酚（gingerol）［3］具有抗炎、抗氧化及免疫调节等药理作用［4］。既往研究［5–6］提示，姜酚可通过调控 miRNA 参与炎症反应调节，但其在细菌感染情境中的关键分子轴与作用环节仍未阐明。外泌体（extracellular vesicles，EVs）是细胞间信息传递的重要载体，可递送miRNA等功能性分子，参与感染与免疫稳态［7］，以及免疫调节等多种病理生理过程，已成为疾病治疗的新兴研究对象［8］。然而，天然产物通过 EVs-miRNA介导抗菌机制的研究鲜有报道。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞非洲绿猴肾细胞（Vero E6）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）购自武汉普诺赛生物有限公司。1.1.2实验动物35只6周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量约20 g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，饲养于合肥综合性国家科学中心大健康研究院ABSL-2级动物房，动物合格证号：B202504140572，伦理号：IHM-AP-2025-016。1.1.3主要试剂及仪器细胞培养生物安全柜、细胞培养箱（美国Thermo公司），酶标仪（美国Thermo Fisher Varioskan公司）；荧光定量 PCR 仪（美国BIO-RAD CF-X96TM公司）；Talos L120CG2透射电镜（美国Thermo scientific 公司）；原子力显微镜（美国Bruker公司）。金葡菌（北京百欧博伟公司，货号：bio-52742）；姜酚（上海MCE公司，货号：HY-14615）；Flotillin-1 Rabbit pAb、Calnexin Rabbit pAb、CD81 Rabbit pAb、血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin） Rabbit pAb （武汉Aclonal公司，货号：A6220、A15631、A5270、A0734PM）； GAPDH Antibody（溧阳亲科生物公司，货号：T0004）；qEV尺寸排阻色谱法外泌体分离柱（qEV柱，新西兰Izon Science Limited公司，货号：qEV10）， Goat Anti-Rabbit IgG （武汉Elabscience公司，货号：E-AB-1003）。1.2方法1.2.1提取细胞培养基中的 EVs收集细胞培养基于4 ℃、2 000 r/min离心10 min 以去除细胞碎片。收集上清液，再于4 ℃、12 000 r/min离心30 min以去除大颗粒物质。随后，使用qEV柱根据制造商说明书分离 EVs。简要流程为：用PBS预平衡后加载样品，按馏分编号收集洗脱组分；参考说明书收集 EVs 富集分馏，另行收集非外泌体分馏作为对照。全程以无菌无核酸酶PBS洗脱与冲洗，柱体每次使用后按说明书彻底清洁。1.2.2透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）取10 μL外泌体悬液滴于碳膜铜网，室温吸附2 min后用滤纸吸去残余液体。加入10 μL 2%磷钨酸负染1 min，吸净染液后室温干燥。将铜网安装在TEM载装台，通过TEM观察并采集图像。1.2.3原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）将新鲜剥离的云母片固定于样品台，取5 μL外泌体样品滴加于云母表面，室温静置10 min使 EVs 吸附。用超纯水轻柔冲洗后晾干。使用探针在敲击模式下进行扫描成像。1.2.4纳米颗粒跟踪分析仪（nanoparticle tracking analysis，NTA）将提取到的 EVs 用浓缩管在4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，再加入 200 μL PBS重悬，反复轻柔吹打，重悬2次，确保所有的 EVs 都被收集。将样本超声处理15 min，超声过程中加冰，保持低温。用1 mL注射器吸取超纯水，将仪器冲洗3次。用1 mL注射器吸取样本，缓慢推进仪器，观察电脑屏幕，出现图案的时候开始拍摄，拍摄时间设置为10 s。拍摄结束后再用超纯水将仪器冲洗3次。PBS将 EVs 样品按需稀释。每次检测前后用超纯水冲洗流路3次以上。1.2.5金葡菌感染细胞细胞分为4组：溶剂对照组（Mock+Vehicle，MV组）、姜酚对照组（Mock+Gingerol，MG组）、金葡菌感染组（S.+Vehicle，SV组）及感染后姜酚治疗组（S.+Gingerol，SG组）。在对数生长期的HUVECs中加入感染复数（multiplicity of infection， MOI）=10的金葡菌，37 ℃、5% CO₂孵育30 min建立感染模型，随后加入姜酚，终浓度为10 μmol/L，37 ℃、5% CO₂ 继续培养18 h。终止后收集细胞上清液至50 mL离心管，PBS冲洗细胞2次，加入10 mL PBS，用细胞刮板刮下并收集细胞。1.2.6金葡菌感染小鼠通过尾静脉注射100 μL PBS重悬且剂量为 1×107 CFU的金葡菌菌液以建立全身感染模型。对照组小鼠注射等体积无菌PBS。感染24 h后，SG组小鼠腹腔注射不同浓度姜酚进行预实验，最终采用浓度为20 mg/kg。对照组注射等体积溶剂。每日监测小鼠体质量和生存状态，于感染后第7天处死小鼠并收集肾脏组织。1.2.7Western blot在样本中加入200 μL的RIPA放在冰上，摇床低速裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，上清液为裂解得到的蛋白质溶液。BCA法定量后将蛋白浓度统一，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，孵育一抗（4 ℃过夜），孵育相应二抗。Flotillin-1 Rabbit pAb 抗体（1∶1 000），Calnexin Rabbit pAb 抗体（1∶1 000），CD81 Rabbit pAb 抗体（1∶1 000），VE-Cadherin Rabbit pAb 抗体（1∶1 000），GAPDH 抗体（1∶100 000），Goat Anti-Rabbit IgG抗体（1∶100 000）。1.2.8细胞免疫荧光感染结束后，用PBS冲洗细胞2次，加入4%细胞固定液，4 ℃固定24 h，PBS洗涤3次。加入通透液破膜，室温15 min，PBS洗涤3次。加入封闭液，室温30 min，PBS洗涤3次。加入一抗，4 ℃过夜，二抗室温避光2 h。最后加入含有抗荧光猝灭剂的RIPA，室温10 min，荧光显微镜下拍照保存。1.2.9组织免疫荧光小鼠肾脏经过脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、抗原修复。随后进行封闭，室温1 h，PBS 洗涤3次。加入一抗孵育，4 ℃ 过夜，二抗室温避光2 h。最后加入含有抗荧光淬灭剂的RIPA。室温10 min后封片，荧光显微镜下拍照保存。1.3统计学处理本研究使用 GraphPad Prism 8.0进行统计分析与作图。数据采用方差分析和t检验，计量数据以x¯±s表示。所有实验至少独立重复3次，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1姜酚有效抑制金葡菌对Vero E6细胞的感染为初步验证姜酚的抗菌效果，课题组首先在易感的 Vero E6 细胞模型中进行检测。免疫荧光染色结果显示，与金葡菌感染组相比，感染后姜酚治疗组的细菌荧光信号强度显著减弱。统计分析进一步证实了该差异的显著性。该结果表明，姜酚能有效抑制金葡菌对Vero E6细胞的侵袭。见图1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F001图 1姜酚降低Vero E6细胞中的S. aureus载量 ×400Fig. 1Gingerol reduced S. aureus load in Vero E6 cells ×400S. aureus is shown in red， and nuclei are stained in blue；**P0.01 vs SV group.2.2姜酚抑制HUVECs的细菌感染并保护内皮细胞屏障完整性免疫荧光检测显示，姜酚处理显著抑制感染HUVECs的细菌量（图2A）。同时，Western blot 结果表明，感染导致细胞间黏合连接蛋白VE-cadherin的表达下调，而姜酚治疗后得到改善（图2B）。说明姜酚不仅能抑制金葡菌感染 HUVECs，还能改善由感染导致的血管内皮损伤，进一步在HUVECs中验证了姜酚的作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F002图 2姜酚在 HUVECs 中抑菌并改善 VE-cadherin表达Fig. 2Gingerol inhibited bacterial growth and modulated VE-cadherin expression in HUVECsA： Immunofluorescence detection of S.aureus infection in HUVECs untreated or treated with gingerol after S.aureus infection ×400； Red fluorescence indicates S.aureus， and blue fluorescence indicates nuclei； B： Western blot detection of VE-cadherin expression in HUVECs； *P0.05，**P0.01 vs SV group； ##P0.01 vs MV group.2.3姜酚抑制 C57BL/6 小鼠的细菌感染本研究成功建立了 C57BL/6 小鼠金葡菌感染模型（图3A）。预实验确定最佳感染剂量为 1×107 CFU，在此剂量下小鼠肾脏指数显著上升且无急性死亡（图3B、3C）。同时，预实验探讨了姜酚的药物浓度（0.5、5、25、50、100 mg/kg），提示25 mg/kg效果较好，浓度≤5 mg/kg没有抑制效果，浓度≥50 mg/kg加重对机体的损伤，于是又设置了（20、25 mg/kg） 2个浓度进行预实验，显示2个浓度均有抑制效果，于是最终采用有效浓度中的较低浓度20 mg/kg，该剂量能有效清除肾脏中的细菌（图4）。在正式实验中，肾脏组织免疫荧光染色证实，与感染组相比，姜酚治疗组，小鼠肾脏中的细菌量显著减少（图5）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F003图3C57BL/6小鼠 S. aureus 感染模型建立与表征Fig. 3Establishment and characterization of the S. aureus infection model in C57BL/6 miceA： Schematic diagram of the mouse model establishment； B： Body weight changes in mice； C： Organ index of mice； *P0.05， ***P0.001 vs Control group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F004图4免疫荧光检测 C57BL/6 小鼠金葡菌感染后不同姜酚浓度的肾脏金葡菌表达 ×200Fig. 4Immunofluorescence analysis of S. aureus burden in kidney sections from C57BL/6 mice ×20010.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F005图 5姜酚对小鼠金黄色葡萄球菌感染的影响Fig. 5The effects of gingerol on S. aureus infection in miceA： Schematic diagram of the mouse model establishment； B： Immunofluorescence detection of S. aureus in mouse renal tissues ×200； S. aureus is stained red， and nuclei are stained blue （DAPI）； **P0.01 vs SV group.2.4HUVECs 培养基 EVs 的提取与鉴定利用尺寸排阻色谱法，从HUVECs培养基中分离出 EVs。TEM与AFM图像清晰展示了典型的杯状囊泡形态（图6A、6B）；纳米颗粒跟踪分析显示颗粒粒径主要分布于 30~150 nm 范围内，符合 EVs 特征（图6C）；Western blot分析进一步证实提取物高表达 EVs 标志蛋白CD81和Flotillin-1，而不表达阴性标志蛋白 Calnexin（图6D）。这些数据共同鉴定了所提取囊泡为 EVs。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F006图6HUVECs细胞上清液中提取的 EVs 的表征检测Fig. 6Isolation and identification of EVs from HUVEC-conditioned mediumA： Morphological analysis of isolated EVs by atomic force microscopy ×20 000； B： Morphological characterization of EVs by transmission electron microscopy ×73 000； C： Size distribution profile of EVs determined by nanoparticle tracking analysis； D： Western blot analysis of EV-specific markers； Blots were probed for positive markers （Flotillin-1 and CD81） and a negative marker （Calnexin）.2.5姜酚处理逆转金葡菌感染后细胞培养基提取的 EVs 中miRNA改变对 EVs 进行 miRNA 测序分析（图7A），显示hsa-miR-320c 的表达在金葡菌感染组上调，而在感染后姜酚治疗组则下调。为进一步阐释 EVs miRNA 在金葡菌感染中的调控作用，本研究基于miRNA测序数据筛选出表达差异显著的hsa-miR-320c进行生物信息学分析。通过TargetScan数据库预测hsa-miR-320c的潜在靶基因，共获得 848个高度保守的靶 mRNA。随后，利用 Metascape 平台对这些靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析，重点聚焦于生物过程（biological process， BP）、细胞组分（cellular component， CC）和分子功能（molecular functions， MF）。GO 分析结果显示，hsa-miR-320c 的靶基因显著富集与细胞间连接及黏附相关的生物学过程，包括 “细胞黏附的正向调节（GO：0045785）”“细胞-细胞连接（GO：0005911）”“细胞附着分子结合（GO：0050839）”（图7B-7D）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.001.F007图 7hsa-miR-320c 靶基因的 gene ontology 富集分析Fig. 7Gene ontology enrichment analysis of hsa-miR-320c target genesA： Exosome miRNA sequencing results； The selected gene hsa-miR-320c was highlighted； B： GO， BPs； Positive regulation of cell adhesion was highlighted； C： GO， CC； Cell-cell junction was highlighted； D： GO， MF； Cell adhesion molecule binding was highlighted； （B-D） The top 18 enriched GO terms for hsa-miR-320c target genes were shown.结合课题组在细胞与组织层面观察到的VE-cadherin变化，上述结果提示，hsa-miR-320c 可能通过靶向多种细胞连接相关基因影响内皮屏障稳态；而姜酚有望通过逆转 hsa-miR-320c的异常表达，间接促进内皮连接蛋白的维持与功能恢复。3讨论本研究基于体内、外模型证实，姜酚能够抑制金葡菌感染，并提示其作用与EVs-miRNA调控密切相关。姜酚可降低细菌负荷、改善内皮黏合连接蛋白VE-cadherin的表达，并可逆转感染诱导的EVs-miRNA异常，尤其是hsa-miR-320c的上调。金葡菌的耐药性问题日益严峻［9］，从天然产物中寻找解决方案具有重要意义。本研究结果表明，姜酚处理能显著降低细胞和小鼠模型中的细菌数量。值得注意的是，其作用远超单纯抗菌。本研究显示，姜酚能显著缓解由感染导致的VE-cadherin表达下调，这对于维持血管内皮屏障完整性至关重要［10］。姜酚采取了一种 “双轨制” 策略：既直接对抗病原体，又同时加固宿主自身的防御屏障，该机制与传统抗生素的作用机制迥异，可能为其克服耐药性提供优势。本研究将姜酚的作用机制与 EVs 介导的细胞间通讯相联系。课题组分离并鉴定了来源于HUVECs培养基的 EVs，观察到感染条件下EVs-miRNA，尤其是 hsa-miR-320c的显著上调，而姜酚处理可部分逆转。结合生物信息学结果，hsa-miR-320c的靶基因富集于细胞黏附与细胞－细胞连接等通路，提示其可能影响内皮连接稳态与屏障功能。基于此，课题组提出一个可验证的研究假说：在金葡菌感染过程中，hsa-miR-320c可能被装载入 EVs 并在内皮细胞间（或内皮－免疫细胞之间）传递，从而调控与黏附－炎症相关的关键基因网络；姜酚通过下调该 miRNA 的表达或其装载－分泌过程，打断不利的信息传递，有助于屏障功能的维持。需要强调的是，关于具体信号轴（例如 NF-κB、自噬相关通路等）的介入仍属推测，尚待功能获得与缺失实验及通路干预实验进一步验证［11］。本研究亦存在若干局限。其一，当前证据支持 hsa-miR-320c 与内皮屏障指标变化的相关性，但未完成在细胞与动物层面的因果性验证（如模拟性过表达、特异性抑制及 EVs 装载阻断等）。其二，动物实验主要评估了肾脏定植及组织学指标，对其他器官影响尚需系统评估。综上，姜酚在抑制金葡菌感染中可能通过多重路径发挥作用：一方面降低细菌负荷，另一方面通过 EVs-miRNA（尤其是 hsa-miR-320c）相关通路维护内皮连接与屏障稳态。本研究为理解姜酚的宿主导向型抗感染机制提供了新的视角，也为围绕 “菌-宿主互作” 的干预策略提供了可行的分子切入点。后续应聚焦于hsa-miR-320c 的因果性与上下游节点验证；与现有抗生素-免疫调节策略的联合优化与适应证界定，以期推动相关天然产物的机制阐明与转化应用。