中国糖尿病患病人数持续攀升，位居全球前列［1–2］。糖尿病可导致视觉系统损伤，严重可致盲。因此，糖尿病的视觉功能损伤一直是眼科和视觉研究工作者关注的热点。研究显示在视网膜血管病变发生之前，视觉信息传递的各个节点（视网膜［3–4］、外膝体、视皮层［5］）均可受到糖尿病的影响从而产生结构和功能的损伤。视觉中枢的损伤更早于眼部的损伤。目前关于糖尿病视觉中枢损伤的研究多依赖影像学方法，或关注阿尔兹海默症与2型糖尿病的混合模型［6］，而阿尔兹海默症本身就伴有神经元丢失的表现。基于前期研究［5］推测糖尿病早期V1萎缩可能与特定神经元亚型损伤有关。该研究综合采用形态学、免疫组化和电生理方法，探讨糖尿病早期小鼠初级视皮层形态学改变和神经网络功能损伤情况，为探索糖尿病所致视觉损伤的神经机制奠定基础。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1实验动物及分组7周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠32只，体质量20~25 g，购自斯贝福（苏州）生物技术有限公司。将小鼠随机分配至正常对照组和糖尿病组，每组16只。所有小鼠均饲养于12 h/12 h明暗交替的SPF级环境中，温度22~25 ℃。本研究经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准（编号：LLSC20230419）。1.1.2主要试剂及仪器链脲佐菌素（streptozotocin，STZ；货号S0130，美国Sigma公司）；三溴乙醇（货号T48402，美国Sigma公司）；尼氏染色液（货号C0117，上海碧云天生物技术有限公司）；钙/钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ（CaMKⅡ）抗体（货号ab52476，英国Abcam公司）；生长抑素（somatostatin，SST）抗体（货号sc74556，美国Santa Cruz公司）。罗氏精采血糖仪及试纸（德国Roched公司）；FV3000共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）；全景组织细胞定量分析系统（奥地利Tissue Gnostics公司）。1×32线性阵列电极（美国NeuroNexus公司）；细胞外电生理信号放大器（美国Blackrock microsystems公司）。1.2方法1.2.11型糖尿病小鼠模型建立选取16只20~25 g的7周龄C57BL/6J雄性小鼠，适应喂养1周。造模前禁食6 h，测空腹血糖及体质量。次日禁食12 h，糖尿病组小鼠按40 mg/kg剂量连续5 d腹腔注射1% STZ溶液，正常对照组小鼠腹腔注射等量的枸橼酸钠缓冲液，30 min内完成注射，注射2 h后恢复喂食。STZ注射结束1周后，禁食6 h，糖尿病组小鼠测得空腹血糖≥11.1 mmol/L视为造模成功。造模后每周监测血糖，第4周行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）试验：禁食6 h后灌胃给予20%葡萄糖溶液（2 g/kg），于0、15、30、60、90、120 min测尾静脉血糖。1.2.2尼氏染色取STZ诱导糖尿病4周小鼠和正常对照小鼠各5只，麻醉后灌流取脑。脑组织经4%多聚甲醛固定24 h，15%、30%蔗糖溶液梯度脱水，包埋鼠脑后冷冻切片。选取对应Paxinos and Franklin's脑图谱Figure 50~51的脑片置于载玻片，4%多聚甲醛溶液固定。尼氏液覆盖脑片，于37 ℃染色10 min，蒸馏水冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。TG全景组织细胞定量分析系统拍摄图像（×10），分辨率96 dpi×96 dpi。根据脑图谱定位V1，用ImageJ软件基于尼氏染色阳性细胞的形态学特征（清晰可见的胞核和胞质，染色深度超过背景阈值）进行人工计数。计数由2名研究者独立完成，取平均值。神经元密度=神经元总数/计数区域面积。1.2.3在体细胞外电生理记录1.2.3.1细胞外单细胞记录法采用异氟烷快速麻醉小鼠并上架固定，夹好嘴夹，持续用1% ~1.5%异氟烷和氧气混合气体麻醉小鼠。小鼠双眼涂抹红霉素眼膏防干燥。碘伏消毒头顶皮肤，剪去毛发头皮，暴露颅骨。以前囟为原点，立体定位仪调平颅顶，用小号钻头在V1区（AP：-3.5 mm，ML：±2.5 mm） 钻孔至硬脑膜并用针头挑开，暴露脑组织。用1×32线性阵列电极垂直向下插入一侧鼠脑V1皮质。小鼠面前30 cm处放置一个显示屏，分辨率为1 920 dpi×1 080 dpi，刷新率为144 Hz，与鼠体轴呈45°夹角。实验使用的视觉刺激是由Matlab软件和心理物理扩展程序包Psychtoolbox-3（PTB-3）编写的特定程序来呈现的正弦移动光栅。刺激对比度设置为高对比度95%，刺激方位为该神经元的最优方位，刺激呈现时间长度设为该神经元最优时间频率，给予的测试刺激分别为0.01、0.03、0.05、0.10、0.21、0.42、0.84 c/d的空间频率刺激。记录神经元对全视野灰色屏幕（空白刺激、亮度等于光栅平均亮度）的反应作为基线活动。每种刺激条件呈现1 s，重复10次。电生理记录在刺激开始前0.5 s启动，刺激结束后0.5 s停止。记录信号经过带通滤波（300~5 000 Hz）和噪声去除。神经元放电信号经胞外放大器放大和模数转换后，存储于计算机中以备后续离线分析。用Plexon Offline Sorter软件对采集到的神经信号进行分离，通过波形特征（峰值、面积、谷值、峰谷比和峰宽等）手动分选和识别单个unit，以分离出单个神经元的活动，再用Matlab程序进行分析。1.2.3.2初级视皮层神经元检测指标① 动作电位波形参数：峰谷比（动作电位波形中峰值与谷值的电压幅度比值）、斜率（波谷后0.5 ms处波形的斜率）、波宽（波峰和波谷的时间差值）。② 诱发放电率：刺激期间放电率减去空白刺激期间放电率，取不同空间频率刺激下诱发放电率的平均值得到该神经元平均诱发放电率。③ 条件放电率（condition firing）：在一对同时记录的神经元中，将其中一个设定为参考神经元A，以其每个动作电位的发放时刻为时间对齐点，统计另一个神经元B在时间窗口内的放电次数，并将神经元B放电次数除以窗口内神经元A的放电次数得到。④ 互信息值（mutual information）： 将刺激呈现时段划分为一系列连续的时间单元，并统计每个单元内各神经元动作电位发放数目，以此将连续的电活动离散化为发放计数序列。以此构建两个神经元发放计数的经验概率分布，包括各自的边缘分布以及两者共同活动的联合分布。依据信息论的基本公式计算互信息，其值等于两个神经元各自活动的熵值之和，减去它们联合活动的熵值，计算出互信息值。⑤ 格兰杰因果关系值（Granger casuality）： 基于神经元群体在响应最优空间频率刺激时的连续活动时间序列，进行多变量格兰杰因果分析。通过比较包含和不包含一个神经元过去活动信息时对另一个神经元当前活动的预测能力，来推断信息流的方向和强度。1.2.4组织化学免疫荧光染色取STZ诱导后第4周的糖尿病组小鼠与正常对照组小鼠各5只，麻醉并灌流取脑、固定脱水、冷冻切片。取对应Paxinos and Franklin's脑图谱Figure 49~64的脑片。10%羊血清室温封闭脑片30 min。CaMKⅡ抗体（1∶500）和SST抗体（1∶50）的一抗混合液于4 ℃孵育脑片24 h，PBS漂洗，用相应二抗混合液室温避光孵育2 h。再次漂洗，DAPI抗淬灭封片剂封片。奥林巴斯FV3000共聚焦显微镜（×20）拍摄V1图像，ImageJ分析图像，以背景区域（无CaMKⅡ胞体与SST阳性结构）随机3个矩形框（100 ~700像素）平均荧光强度的“均值+3倍标准差”为阳性信号阈值，进行共定位、平均荧光强度及积分光密度分析。1.3统计学处理采用Graphpad Prism 9.3软件进行统计学分析。计量资料用Kolmogorov-Smirnov test评估正态性，符合正态分布的计量数据以x¯±s表示。采用Bartlett's test证实组间方差齐性。符合正态分布且方差齐的计量数据，两组间差异采用独立样本t检验分析。符合正态分布且方差不齐的计量数据，两组间差异采用Welch's t test分析。不符合正态分布的计量数据以中位数（IQR）表示，两两比较采用Mann-Whitney test。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1糖尿病组小鼠造模后与正常对照组小鼠的一般情况比较相比正常对照组，糖尿病组小鼠在注射STZ后逐渐出现多饮、多尿、多食，并持续存在。注射STZ溶液1周后，糖尿病组16只小鼠血糖为（13.67±2.25）mmol/L。糖尿病组小鼠多蜷缩少动，对外界刺激（如声音、轻触）反应更迟缓，整体状态较正常对照小鼠萎靡，体型更小且圆润，毛发杂乱无光泽。OGTT显示糖尿病组摄入葡萄糖后血糖较正常对照组快速上升，但恢复更缓慢（t=9.21，P=0.000 8；t=13.29，P=0.000 2；t=13.25，P=0.000 2；t=11.47，P=0.000 3；t=21.75，P0.000 1；t=17.00，P0.000 1；图1）。糖尿病组16只小鼠均造模成功。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.F001图1两组小鼠的OGTT结果比较Fig. 1Comparison of OGTT results between control mice and diabetes mice***P0.001，****P0.000 1 vs Control group.2.2糖尿病早期小鼠 V1形态学变化经尼氏染色后两组脑片图像，见图2A、2B。糖尿病组V1厚度较正常对照组明显更薄（t=2.51，P=0.02；图2C、2D），V1神经元密度较正常对照组显著下降（t=2.75，P=0.01；图2E、2F）。糖尿病组小鼠和正常对照组小鼠的半脑片面积（t=0.29，P=0.78）和外侧膝状体（lateral geniculate body，LGN）面积（t=0.98，P=0.34）的差异无统计学意义（表1）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.F002图2两组小鼠尼氏染色脑片图像 ×10Fig. 2Representative Nissl-stained brain sections from the two groups of mice ×10A， B： Representative Nissl-stained brain sections from control and diabetes mice （scale bar： 500 μm）； C， D： Example images showing the differences in V1 thickness between control and diabetes mice； E， F： Example images illustrating the differences in neuronal density in V1 between control and diabetes mice.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.T001表1两组V1皮质形态学结果比较（x¯±s）Tab. 1Comparison of V1 cortical morphology between the two groups （x¯±s）VariableControl（n=5）Diabetes（n=5）t valueP valueThickness （μm）847.79±37.51814.07±36.052.510.02Neuronal density （cells/mm²）1 477.75±227.011 295.40±120.352.750.01Hemispheric slice area （mm²）23.62±1.3123.74±1.020.290.78LGN area （mm²）0.34±0.070.32±0.040.980.342.3糖尿病早期小鼠V1神经元电生理活动异常与动作电位波形变化在体细胞外电生理记录实验中，两组分别记录了6只小鼠电生理数据。其中正常对照组共记录到498个神经元，糖尿病组共记录到451个神经元。正常小鼠V1神经元典型动作电位波形及参数，见图3A。糖尿病组V1神经元动作电位曲线峰谷相对深度较正常对照组更浅，曲线更平缓，见图3B。糖尿病组V1神经元曲线峰谷比较正常组下降（t=3.257，P=0.001 2，图3C）。糖尿病组V1神经元曲线斜率的绝对值较正常对照组减小（t=2.797，P=0.005 3，图3D）。两组V1神经元波宽差异无统计学意义（t=0.636 1，P=0.524 8，图3E）。糖尿病组V1神经元诱发放电率较正常对照组升高（t=4.249，P0.000 1，图3F）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.F003图3V1神经元电活动异常与动作电位波形受损Fig. 3Impaired electrical activity and action potential waveforms in V1 neuronsA： Schematic representation of typical action potential waveform and waveform parameter in V1 neurons； B： Comparison of averaged action potential waveforms from V1 neurons between the two groups； C-F： Quantitative comparisons of action potential waveforms properties and evoked firing rates between groups； **P0.01，****P0.000 1 vs Control group.2.4糖尿病早期小鼠V1神经元网络功能连接受损通过分析神经元对之间的条件放电率，绘制了反映兴奋性功能连接的热图（图4A）。正常对照组热图中存在大量密集分布的深色区域，糖尿病组热图整体色调明显更浅淡，蓝色区域稀疏且强度减弱。正常对照组典例图整体平均灰度值为186.206，糖尿病组典例图整体平均灰度值为219.871。糖尿病组V1神经元间的条件放电率0.369 2（0.348 1）、互信息值0.003 5（0.008 9）、格兰杰因果关系值0.008 6（0.010 2）均相对正常对照组的条件放电率0.441 3（0.349 5）、互信息值0.006 7（0.017 5）、格兰杰因果关系值0.011 4（0.015 6）下降，差异有统计学意义（P0.000 1，图4B-4D）。2.5糖尿病组小鼠V1区SST表达及抑制性输入组织化学免疫荧光图像见图5。由表2可知，糖尿病组V1的SST阳性信号面积荧光信号相对正常对照组V1区减少，尽管该差异未达到传统显著性水平（t=2.03，P=0.05）。采用图像阈值分析法对免疫荧光阳性信号区域进行量化，结果显示两组间V1的CaMKⅡ阳性信号面积差异无统计学意义（t=1.46，P=0.16）。糖尿病组SST荧光积分光密度相对正常对照组明显减少（t=2.68，P=0.01）。糖尿病组SST平均荧光强度显著上升（t=2.98，P=0.01）。与正常对照组相比，糖尿病组V1区CaMKⅡ+神经元上的SST阳性信号共定位密度显著降低（t=2.63，P=0.02）。两组CaMKⅡ的平均荧光强度（t=0.35，P=0.73）和荧光积分光密度（t=1.30，P=0.21）之间的差异均无统计学意义（表2）。图5正常对照组和糖尿病组V1区免疫荧光染色结果Fig. 5Immunohistochemistry results of V1 area in control and diabetic miceA， F： Panoramic views of immunohistochemistry images of V1 in control （A） and diabetic （F） groups ×20； B-E： Representative individual channel images from the partial region of V1 in control mice ×100； G-J： Representative individual channel images from the partial region of V1 in diabetic mice ×100.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.F4a1scale value for the representative control heatmap is 186.206， while that for the diabetic group is 219.871 （higher grayscale values correspond to lighter colors）； B-D： Comparisons of pairwise neuronal interactions between groups， conditional firing （B）， mutual information （C）， and Granger causality（D）； ****P0.000 1 vs Control group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.F4a210.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.05.010.T002表2两组小鼠V1区CaMKⅡ与SST免疫荧光及共定位定量分析结果 （x¯±s）Tab.2Quantitative analysis of CaMKⅡ and SST immunohistochemistry and their colocalization of V1 between two groups （x¯±s）VariableControl（n=5）Diabetes（n=5）t valueP valueCaMKⅡ-positive area （μm²）180 198.20±86 789.10142 601.48±48 835.791.460.16CaMKⅡ mean fluorescence intensity118.76±38.91125.55±63.870.350.73CaMKⅡ integrated optical density66 792.48±41 001.0449 734.17±30 201.261.300.21SST-positive area （μm²）81 629.77±62 727.3543 222.96±37 616.242.030.05SST mean fluorescence intensity57.38±10.5485.68±35.302.980.01SST integrated optical density57 742.82±48 664.8621 671.29±18 540.352.680.01Colocalization density of SST with CaMKⅡ+ neurons （counts/mm²）1 225.79±836.74599.36±385.532.630.023讨论既往研究表明，脑萎缩与神经元丢失是阿尔兹海默症［7–8］和帕金森病［9］等中枢神经系统退行性疾病的共同病理特征。近年来，糖尿病对中枢神经系统的损害及其与上述疾病相似的机制也受到关注［10］。动物实验提示，在视网膜微血管改变前，糖尿病大鼠初级视皮层锥体神经元已发生萎缩；影像学研究发现，无视网膜血管病变的2型糖尿病患者的枕叶皮层等视觉相关脑区已存在异常［11］。然而，目前相关研究主要依赖影像学手段，尚缺乏形态与功能层面的深入证据。本研究通过构建STZ诱导的1型糖尿病早期小鼠模型，采用尼氏染色实验观察到其V1出现厚度变薄和神经元密度降低的情况。皮层变薄是脑萎缩的典型表现［8］，而神经元丢失则是其病理基础，这说明糖尿病小鼠在早期已出现V1区萎缩。本文电生理结果揭示了V1神经网络的功能障碍：糖尿病小鼠V1神经元表现为电活动异常活跃、动作电位波形变缓。更重要的是，V1神经元集群间的功能连接指标，包括条件发放率、互信息值和格兰杰因果关系值均显著下降。这些结果表明，神经元间协同放电的时序精确性、信息共享量以及信息流的方向性均受到损害，导致V1高效的信息处理网络变得松散和低效。皮层神经元分为兴奋性神经元与抑制性神经元。兴奋性神经元（CaMKⅡ+）占皮层神经元数量的80%，主要负责神经信息的远程传递与整合，维持大脑基本生理活动［12］。抑制性神经元主要包括SST、PV与VIP神经元，其中SST神经元是大脑皮层中至关重要的抑制性神经元，其作用是调节兴奋性神经元活动［13］。本研究结果显示，糖尿病早期V1区的CaMKⅡ总体表达水平未发生显著改变，但SST的总光密度显著降低，免疫阳性面积亦呈减少趋势，而其平均荧光强度却有所上升。共定位分析显示，CaMKⅡ+神经元上的SST阳性信号密度下降。据此推测：SST荧光强度的升高可能是一种代偿反应［14］，即SST神经元试图通过增加神经肽表达以应对网络抑制功能减弱；共定位密度下降则从形态学上证实，SST能神经末梢对兴奋性神经元的实际支配已然减少。这种“无效代偿”最终导致网络抑制功能衰退，与电生理观测到的神经元兴奋性升高及功能连接减弱结果一致。糖尿病引发的氧化应激与持续高血糖可直接损伤神经元轴突及其末梢［15］；同时，糖尿病状态下脑内具有突触保护作用的脑源性神经营养因子表达减少，也可能削弱对兴奋性神经元的功能调控。因此，SST能神经末梢对兴奋性神经元支配的减弱，很可能是上述多重机制共同作用的结果。本研究存在一定的局限性。首先，神经元共定位分析基于常规共聚焦显微成像，而非超高分辨率技术。其次，研究虽通过免疫荧光获得了目标蛋白的空间分布信息，但未经Western blot进一步验证其表达水平。此外，本研究主要关注1型糖尿病模型，其结果在2型糖尿病中的适用性尚需进一步验证。