隐孢子虫病是一种由隐孢子虫引起的人畜共患原虫病[1]。目前，已有37个隐孢子虫的有效种得到鉴定。牛可感染4个有效种：牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫[2-4]。安氏隐孢子虫于胃内寄生，其余3种隐孢子虫则寄生于肠道[5]，上述隐孢子虫均可引起肠和胃黏膜损伤，降低胃肠道吸收功能，进而导致腹泻。隐孢子虫被认为是全球水媒和食源性腹泻疾病暴发的常见原因[6-7]。因此，隐孢子虫的防治尤为重要。国内关于隐孢子虫流行病学调查结果显示，同一奶牛场内断奶前犊牛感染率高于其他年龄段奶牛[8-9]。犊牛感染隐孢子虫的主要表现为精神沉郁、厌食和腹泻，严重可导致死亡；粪便呈灰白色或黄褐色，含有大量纤维素、血液和黏液，后期呈透明水样粪便[10]。为全面准确地调查邯郸市地区奶牛隐孢子虫感染的种类和流行病学情况，本试验以邯郸5个县（区）养殖场的犊牛为研究对象，通过分析邯郸不同地区和不同月龄犊牛感染隐孢子虫的感染情况，评价隐孢子虫对邯郸地区犊牛的影响，为控制隐孢子虫病的传播情况提供参考，对邯郸市地区畜禽的健康具有重要的公共卫生学意义。1材料与方法1.1样品采集2020年1月至5月，从邯郸5个县（区）的养殖场随机采集犊牛的新鲜粪便400份（成安县、魏县、临漳县以及邯山区、肥乡区各80份）。其中0~3月龄犊牛粪便样品数量为240份，4~6月龄犊牛粪便样品数量160份，每份样品10~50 g，密封编号，4 ℃保存。1.2仪器与试剂主要仪器：LXJ-IIZ自动脱盖离心机（上海安亭科学仪器厂）、XSP-00光学显微镜（宁波湛京光学仪器有限公司）、电子秤（上海赫尔普国际贸易有限公司）、玻璃棒、离心管、60目铜筛和120目铜筛、酒精灯、自制铁丝环、载玻片、盖玻片、密封袋、马克笔、一次性塑料滴管等。主要试剂：饱和蔗糖溶液（1 000 g蔗糖∶640 mL蒸馏水）、石炭酸品红染色液、3%盐酸酒精、2%孔雀绿染液、2.5%重铬酸钾溶液（2.5 g重铬酸钾∶1 L蒸馏水）。1.3试验方法1.3.1隐孢子虫的收集采用饱和蔗糖溶液漂浮法，每份被检粪便样品取10~50 g，按1∶6比例加入自来水，搅拌均匀，经60目和120目铜筛两遍过滤，3 600 r/min离心5 min，弃去上清液，将沉淀物加入饱和蔗糖溶液（1∶1），搅拌均匀后3 600 r/min离心5 min，卵囊漂浮于上层。吸取表层液于离心管，加入适量的自来水，3 600 r/min离心5 min，沉淀物即为隐孢子虫，保存于2.5%重铬酸钾溶液。1.3.2改良抗酸染色法及虫种鉴定因隐孢子虫卵囊较小，若直接涂片，卵囊检出率极低，故采用改良抗酸染色法进行卵囊染色。蘸取上层液移于载玻片上，加石炭酸复红染液2~3滴进行首次染色，缓慢加热约5 min，水洗；以3%盐酸酒精脱色1~3 min，水洗；2%孔雀绿复染液染色约1 min，蒸馏水洗涤后以吸水纸吸干，1 000倍油镜下观察卵囊。测量100个卵囊的长宽径值，结合形态特征鉴定虫种。2结果与分析2.1邯郸地区不同地点犊牛隐孢子虫的感染率（见表1）由表1可知，邯郸地区不同地点犊牛隐孢子虫病的平均感染率为5.75%（23/400）。由于县（区）牛场环境和地理位置存在一定差别，犊牛隐孢子虫病感染率有所不同；其中邯山区隐孢子虫病感染率最低，为1.25%（1/80）；成安县和肥乡区隐孢子虫病感染率稍高，成安县感染率为7.50%（6/80），肥乡区感染率为10.00%（8/80）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.015.T001表1邯郸地区不同地点犊牛隐孢子虫的感染率Tab.1Cryptospridium infection rate of calves in different regions of Handan项目阳性头数/份样本数/份感染率/%成安县6807.50魏县3803.75临漳县5806.25邯山区1801.25肥乡区88010.00合计23400—平均值——5.752.2邯郸地区不同月龄犊牛隐孢子虫的感染情况（见表2）由表2可知，不同月龄犊牛隐孢子虫的感染率具有差异，其中0~3月龄犊牛隐孢子虫感染率较高，为6.67%（16/240）；4~6月龄犊牛隐孢子虫感染率较低，为4.38%（7/160）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.015.T002表2不同月龄犊牛隐孢子虫的感染率Tab.2Cryptospridium infection rate of calves in different months组别阳性头数/份样本数/份感染率/%0~3月龄162406.674~6月龄71604.38合计23400—平均值——5.752.3犊牛隐孢子虫的形态鉴定（见图1）由图1可知，经饱和蔗糖溶液漂浮的卵囊均呈淡玫瑰红色，卵囊外围环绕淡绿色的光圈，卵囊形状为圆形或卵圆形，卵囊壁较薄，无微孔和极粒，光滑无色。经改良抗酸染色后卵囊呈深玫瑰红色，残体背景为绿色，非特异性颗粒为蓝黑色，大部分卵囊内子孢子为结构模糊的环状结构，卵囊平均大小5.0 μm×4.5 μm。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.015.F001图1犊牛粪便中的微小隐孢子虫Fig.1Cryptosporidium parvum in calf feces本调查结果与文献报道的感染月龄及形态大小相似，可初步鉴定为调查采集样本中检出虫种微小隐孢子虫。3讨论隐孢子虫是一种主要寄生于哺乳动物胃肠道上皮细胞刷状缘的寄生原虫，具有广泛的宿主范围，可感染包括人在内的240多种动物，可通过水源、食物、空气等多种途径传播。隐孢子虫主要引起幼龄动物的消化道和呼吸道疾病，可降低其生产性能，严重可导致死亡。隐孢子虫病是重要的人畜共患寄生虫病之一，是仅次于轮状病毒的第二大腹泻病原[11]，已被列为世界最常见的6种腹泻疾病之一，并被世界卫生组织和美国疾病预防控制中心列入新发传染病。2003年，该病也被我国列为重点防范的两个重要新发寄生虫病之一。Cui等[12]研究发现，宁夏某奶牛场大量犊牛发生腹泻，病死率高达10%以上，其中2~3周龄犊牛的隐孢子虫感染率高达83.3%。本研究对邯郸地区犊牛隐孢子虫的感染情况进行了调查，从感染率和虫种鉴定方面进行分析，对邯郸地区隐孢子虫病防控工作具有重要意义。本试验调查的400份犊牛粪便样品中，23份粪便样品的隐孢子虫检验结果为阳性，阳性率为5.75%（23/400）。任冠静等[13]对陕西断奶后犊牛的一项调查发现，隐孢子虫总感染率为16.8%（19/113），其调查结果与本调查结果差异较大，原因可能是地区与样本数量存在差异。本试验中，邯郸地区的5个县（区）调查结果均存在差异，表明不同地区犊牛隐孢子虫的感染率不同，可能与地理位置和饲养管理及卫生条件等存在密切联系。调查中，0~3月龄和4~6月龄犊牛隐孢子虫感染感染率差异明显，0~3月龄感染率较高，阳性率为6.67%。Garber等[14]研究发现，1~3周龄新生犊牛隐孢子虫总体感染率较高，为48.0%。Fayer等[15]研究发现，犊牛隐孢子的感染率为20.5%。Wegayehu等[16]研究指出，在不同的国家和地区，牛微小隐孢子虫的流行情况与牛的品种、年龄和地理位置等有关。早期针对隐孢子虫的鉴别诊断主要通过显微镜观察，寄生于牛的隐孢子虫感染种类未能进行准确地鉴定；随着分子生物学技术的发展，目前检测隐孢子虫感染的方法包括病原形态学、分子生物学和免疫学等。病原形态学主要为染色法、漂浮法和沉淀法；分子生物学方法主要有普通PCR、巢式PCR、反转录PCR（RT-PCR）、实时荧光定量PCR（real-time PCR）、PCR-限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）、环介导等温扩增（LAMP）等检测技术，是所有检测方法中最迅速、最敏感、最方便的检测方法之一；免疫学方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光法、单克隆抗体技术以及流式细胞术等方法。我国最常用的检测方法是漂浮法和PCR方法，通过分子生物学手段可以进行隐孢子虫虫种鉴定、基因分型、溯源研究及人畜共患病风险评估。牛作为隐孢子虫的主要感染宿主，奶牛犊牛主要通过粪便以及粪便污染的饮水、饲料感染隐孢子虫，犊牛住进未经过彻底清洗消毒的犊牛舍常导致新生犊牛大量发病。有研究显示，过滤式软体动物已被认为是隐孢子虫病的潜在来源，但迄今为止尚无公认的暴发记录[17]。随着我国牛进口数量急剧增加，牛隐孢子虫病现在已经成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一，应引起高度重视，降低隐孢子虫病造成的经济损失。4结论关于犊牛隐孢子虫病报道较多，但尚未研制出具有显著临床疗效的药物或疫苗。本试验通过调查邯郸地区犊牛隐孢子虫的感染情况，为控制隐孢子虫病的传播提供参考，为邯郸地区犊牛隐孢子虫病的防控与治疗提供了依据，对邯郸地区畜禽的健康具有重要的公共卫生学意义。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.015.F002