松针中除含有氨基酸、矿物质、维生素等营养成分，还含有精油和单宁等具有抑菌、杀菌作用的物质，可作为绵羊、山羊的饲料原料来源。山羊基础日粮中采用8%和12%的松针粉替代等比例稻草，可提高山羊的日采食量和日增重[1]。绵羊采食含20%鲜松针的饲草时，其增重与全部采食牧草的绵羊增重相近[2]。Anderson[3]报道，绵羊每只每天采食松叶260 g，10 w后未发现不良影响。但日粮中松针添加量超过一定范围，可降低反刍动物采食量和日粮养分消化率。Adams等[4]采用12.5%、25.0%、50.0%的松针替代冰草饲喂羔羊，结果发现，添加50.0%的松针显著降低羔羊的干物质采食量和氮存留量，日粮干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率显著降低。Pfister等[5]研究表明，以15%、30%的松针粉替代干草，对阉牛的干物质采食量无明显影响，粗蛋白质消化率有降低趋势。目前，利用松针含有的杀菌、抑菌活性物质，已成功制作松针和苜蓿混合青贮饲料[6-7]。本课题组前期研究发现，随松针与苜蓿混合青贮中松针比例量的增加，育肥羔羊日增重下降[2]，日粮粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率降低[8]。瘤胃是反刍动物的主要消化器官，日粮组成和成分可影响瘤胃发酵和瘤胃菌群结构。饲喂松针与苜蓿混合青贮能否改变反刍动物瘤胃发酵和瘤胃微生物结构，迄今尚无报道。因此，本研究以哈萨克公羔羊为试验对象，育肥羔羊日粮中添加不同比例的松针与苜蓿混合青贮饲料，探索其对育肥羔羊瘤胃发酵和细菌多样性的影响，为松针与苜蓿混合青贮在羊生产中的应用提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料混合青贮饲料于2019年6月制作，9月开窖。原料由初花期紫花苜蓿、樟子松松针和玉米粉组成。以苜蓿鲜重计，分别调制10%玉米粉+90%苜蓿和30%松针+70%苜蓿两种混合青贮饲料。1.2试验设计试验采用单因素试验设计。选择50只健康、体重相近（35.31±1.49）kg的哈萨克公羔羊，随机分5组，每组10只羔羊。以干物质为基础，日粮精粗比为50∶50，其中，小麦秸秆占日粮15%，青贮饲料占日粮35%。青贮饲料由2种苜蓿混贮料按比例混合，松针与苜蓿混合青贮在青贮饲料中所占比例分别为0、1/6、1/3、2/3、1，松针在混合青贮（鲜重基础）中的比例分别为0（Ⅰ组）、5%（Ⅱ组）、10%（Ⅲ组）、20%（Ⅳ组）、30%（Ⅴ组），其中Ⅰ组为对照组。试验期75 d，其中预试期15 d，正式试验期60 d。正式试验期最后1 d，每组选取4只育肥羔羊，采集瘤胃液，测定瘤胃液pH值、氨态氮浓度、挥发性脂肪酸含量及瘤胃微生物多样性。1.3试验日粮与饲养管理参照《肉羊饲养标准》[9]（NY/T 816—2004）35 kg体重、平均日增重为200 g/d的育肥羊营养需要量及《绵羊用精饲料》[10]（GB/T 20807—2006）设计日粮配方。基础日粮组成及营养水平见表1。青贮料及日粮的营养水平的测定方法参考文献[11]。混合青贮饲料消化能（DE）估测模型DE（MJ/kg）=17.211-0.135NDF[12]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组原料组成/%玉米33.0032.3531.9431.2830.80麸皮5.505.906.005.955.70豆粕5.505.756.066.377.00棉粕5.005.005.005.405.50食盐0.500.500.500.500.50预混料0.500.500.500.500.50麦秸15.0015.0015.0015.0015.00混合青贮35.0035.0035.0035.0035.00合计100.00100.00100.00100.00100.00营养水平消化能/(MJ/kg)11.5211.5111.5111.5011.50粗蛋白质/%14.3914.3914.3914.3914.39中性洗涤纤维/%33.2733.7634.1534.9435.68酸性洗涤纤维/%21.8522.2622.6223.3824.12钙/%0.530.540.560.590.62磷/%0.340.340.340.330.32注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 1 500 IU、VD 200 IU、VE 20 IU、铁 50 mg、铜15 mg、锰40 mg、锌40 mg、碘1.5 mg、钴0.30 mg、硒 0.20 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。饲养试验于2019年9月—11月在新疆沙湾县肉羊育肥场进行。试验羊采用全舍饲饲养，人工饲喂。试验前对试验羔羊进行驱虫、消毒及编号等操作。试验期内对圈舍进行定期消毒。每日9：00和18：00定时饲喂，先粗料后精料，自由饮水。1.4试验方法1.4.1瘤胃液采集与保存正式试验期最后1 d，每组选取4只育肥羔羊，采集瘤胃液约150 mL，混匀，以4层纱布过滤，分装于10 mL离心管中。一部分瘤胃液-20 ℃保存，用于测定瘤胃发酵参数；另一部分瘤胃液-80 ℃保存，用于测定瘤胃液微生物多样性。1.4.2瘤胃发酵参数测定pH值采用雷磁PHSJ-3F pH计现场测定。氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法[13]测定。采用高效液相色谱法[14]测定挥发性脂肪酸（VFA）含量。1.4.3瘤胃微生物多样性测定采用十六烷基三甲基溴化铵法提取总DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，使用Qubit荧光计和NanoDrop分光光度计测定DNA浓度、质量和完整性。根据细菌16S rRNA基因V3~V4区保守序列，设计上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反应程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环；72 ℃延伸5 min，10 ℃保温。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物纯化回收，将PCR扩增回收产物进行荧光定量分析。根据结果，按照每个样本的测序量需求及其相应的比例进行混合，利用Illumina Novaseq高通量测序平台进行分析。测序结束，对高通量测序的原始下机数据进行质量初筛，对问题样本进行重测或补测。通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程进行97%的相似度对序列进行操作分类单元（OTUs）聚类，对OTUs进行分类学注释。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2016初步整理，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1松针与苜蓿混合青贮对育肥羔羊瘤胃发酵参数的影响（见表2）由表2可知，试验Ⅰ组育肥羔羊瘤胃pH值和乙酸浓度均显著低于Ⅴ组（P0.05）；试验Ⅰ组、Ⅱ组育肥羔羊瘤胃氨态氮浓度显著高于试验Ⅴ组（P0.05）；试验Ⅰ组育肥羔羊瘤胃丙酸和丁酸浓度显著高于Ⅴ组（P0.05）；试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组育肥羔羊瘤胃乙酸/丙酸均显著低于Ⅴ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.T002表2松针与苜蓿混合青贮对育肥羔羊瘤胃发酵指标的影响组别pH值氨态氮/(mg/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)乙酸/丙酸丁酸/(mmol/L)试验Ⅰ组6.39±0.11b99.30±6.70a55.32±7.64b23.62±3.50a2.34±0.56b8.08±1.24a试验Ⅱ组6.47±0.18ab92.20±8.10a56.49±5.62ab21.77±3.01ab2.59±0.41b7.58±0.69ab试验Ⅲ组6.65±0.23ab90.70±8.40ab57.36±6.11ab21.24±2.52ab2.70±0.50b7.53±1.02ab试验Ⅳ组6.66±0.17ab85.50±9.30ab61.01±6.23ab18.67±3.70ab3.27±0.66ab7.52±1.21ab试验Ⅴ组6.70±0.15a80.90±4.70b65.89±4.16a17.05±2.52b3.86±0.38a6.09±0.70b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2松针与苜蓿混合青贮对育肥羔羊瘤胃微生物多样性的影响2.2.1样品序列测序深度和α多样性分析（见图1、图2、表3）采用Illumina Novaseq测序平台，对5组瘤胃液样本进行测序，原始数据经初筛、拼接、去噪、剔除等过滤，得到792 951条高质量有效序列，平均每个样本reads数为39 648。由图1可知，随测序深度的不断加深，各组样品稀释曲线最终趋于平缓。结果显示，样本测序量已经饱和，大多数菌群被覆盖。本试验测序深度能够反映样本中绝大部分细菌物种的信息。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.F001图1育肥羔羊瘤胃微生物样品序列测序深度分析由图2可知，各组OTUs个数分别为7 165、7 457、8 233、7 580、5 102。5组共有的OTUs个数为199，各组特有的OTUs个数分别为4 672、4 709、5 753、5 243、3 801。结果显示，5个试验组菌群的构成同时具有相似性和特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.F002图2育肥羔羊瘤胃微生物样品的OTUs聚类分析由表3可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅴ组育肥羔羊瘤胃微生物样品中Chao1指数显著降低（P0.05），试验Ⅲ组Chao1指数显著提高（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅳ组差异不显著（P0.05）；试验Ⅴ组育肥羔羊瘤胃微生物样品中Observed species指数显著降低（P0.05），试验Ⅲ组Observed species指数显著升高（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅳ组Observed species指数差异不显著（P0.05）；试验Ⅳ组、Ⅴ组育肥羔羊瘤胃微生物样品中Goods coverage均显著升高（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅲ组Goods coverage均差异不显著（P0.05）。试验Ⅰ~Ⅳ组育肥羔羊瘤胃微生物样品中Shannon指数和Simpson指数均显著高于Ⅴ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.T003表3Alpha多样性指数分析组别Chao1指数Observed species指数Shannon指数Simpson指数Goods coverage试验Ⅰ组3 304.88±276.42b2 871.43±207.21b9.81±0.13a0.997 0±0.000 3a0.974±0.003c试验Ⅱ组3 496.66±146.95ab3 017.73±157.17ab9.82±0.13a0.997 0±0.000 4a0.972±0.001c试验Ⅲ组3 604.64±130.09a3 220.45±134.65a9.85±0.10a0.997 0±0.000 3a0.973±0.002c试验Ⅳ组3 327.01±114.08b3 039.75±99.83ab9.79±0.06a0.996 0±0.000 3a0.977±0.002b试验Ⅴ组2 651.30±78.70c2 288.13±69.38c7.73±0.12b0.922 0±0.005 2b0.980±0.001a2.2.2育肥羔羊瘤胃微生物样品的PCoA聚类分析（见图3）由图3可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为72.3%、11.0%。每个样品根据所在组别的不同而互相聚类到一起。结果显示，组内相似性高于组间相似性。与试验Ⅰ组相比，试验Ⅳ组距离最近，试验Ⅴ组距离最远，试验Ⅰ组细菌组成与试验Ⅳ组相似性高，与试验Ⅴ组相似性低，饲喂松针与苜蓿混合青贮料改变了瘤胃细菌组成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.F003图3PCoA聚类分析2.2.3瘤胃细菌组成分析（见表4、表5）由表4可知，试验组间拟杆菌门相对丰度差异不显著（P0.05）。与试验Ⅰ组相比，试验Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组厚壁菌门相对丰度显著降低（P0.05），互养菌门相对丰度显著提高（P0.05）；试验Ⅴ组变形菌门相对丰度显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.T004表4瘤胃优势菌群在门水平上的相对丰度组别拟杆菌门厚壁菌门互养菌门变形菌门Ⅰ组53.24±1.5643.38±0.92a0.39±0.15c1.01±0.25aⅡ组52.97±2.6942.55±0.71ab1.41±0.16bc0.81±0.14aⅢ组52.22±2.5540.93±0.66bc2.58±0.43b0.63±0.18abⅣ组51.70±1.8440.28±0.42c3.90±0.85a0.77±0.14abⅤ组51.48±2.2639.68±0.57c4.16±0.57a0.32±0.10b%由表5可知，随着松针添加水平提高，普雷沃菌属、产琥珀酸菌属、丁酸弧菌属和瘤胃球菌属相对丰度均呈逐渐降低的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.004.T005表5瘤胃优势菌群属水平相对丰度组别普雷沃菌属产琥珀酸菌属瘤胃球菌属丁酸弧菌属Ⅰ组19.67±2.06a4.64±0.31a2.72±0.44a2.97±0.57aⅡ组15.46±2.32ab4.20±0.21b1.68±0.31b2.05±0.39bⅢ组14.94±1.73ab3.25±0.14c1.24±0.20c1.89±0.29bⅣ组14.29±1.53ab2.22±0.14d0.67±0.07d1.87±0.29bⅤ组12.41±2.50b1.92±0.11d0.63±0.07d0.71±0.15c%其中，试验Ⅰ组普雷沃菌属相对丰度显著高于Ⅴ组（P0.05），产琥珀酸菌属、瘤胃球菌属以及丁酸弧菌属相对丰度均显著高于其余各组（P0.05）。3讨论3.1松针与苜蓿混合青贮对育肥羔羊瘤胃发酵参数的影响瘤胃液pH值受日粮性质、唾液分泌以及瘤胃内酸碱性物质排出、吸收或中和的影响，能够反映瘤胃内环境状况及饲料在瘤胃内的发酵程度[15]。瘤胃液的pH值正常范围5.5~7.5[16]。本试验中，各试验组瘤胃液的pH值为6.39~6.70，均处于正常范围，表明饲喂松针与苜蓿混合青贮料未使瘤胃pH值产生异常。饲料的构成和采食量的变化是导致反刍动物瘤胃pH值发生波动的主要因素。本试验结果显示，羔羊瘤胃pH值随着混合青贮中松针水平的提高呈上升趋势，试验Ⅰ组羔羊瘤胃pH值显著低于Ⅴ组。试验Ⅰ组羔羊所采食10%玉米和苜蓿混合青贮的pH值显著低于30%松针和苜蓿混合青贮所致。瘤胃中的氨态氮主要来源于食糜中的含氮物质的降解，氨态氮浓度反映瘤胃微生物分解含氮物质产氨的速度及其对氨的摄取利用情况[17]。研究表明，微生物生长对氨氮浓度耐受的临界范围为60~300 mg/L[18]。本试验中，瘤胃液氨态氮浓度范围为80.9~99.3 mg/L，5个试验组的瘤胃氨态氮浓度均符合瘤胃微生物合成蛋白质所需的范围。瘤胃氨态氮浓度随着混合青贮中松针水平的提高呈下降趋势，试验Ⅰ组、Ⅱ组羔羊瘤胃氨态氮浓度显著高于Ⅴ组。有研究表明，植物精油可能会抑制瘤胃中超级产氨菌的活性，降低氨基酸的脱氨基作用[19]。Cao等[20]研究发现，丁香油、百里香油、茴香油、薄荷油、茶树油等植物精油均具有降低体外发酵瘤胃液氨态氮浓度的能力。单宁能够与植物中的蛋白质结合，降低瘤胃中蛋白质的溶解度，避免被瘤胃微生物降解。有研究表明，以富含单宁的红豆草饲喂绵羊，可显著降低绵羊瘤胃内的氨态氮浓度[21]。松针含松针精油和单宁等次级代谢产物，本试验中，瘤胃氨态氮浓度随着混合青贮中松针比例的提高而下降趋势，与羔羊日粮中松针精油和单宁含量的增加有关。VFA是瘤胃发酵的主要终产物，是反刍动物机体所需能量来源，主要由乙酸、丙酸、丁酸等构成，约占瘤胃VFA的95%。本试验条件下，随混合青贮中松针水平的提高，VFA的组分比例发生变化，瘤胃乙酸浓度上升，丙酸、丁酸浓度下降，乙酸/丙酸升高。结果显示，提高松针添加比例影响瘤胃发酵，混合青贮中松针精油的作用结果。某些植物精油及其组分会改变挥发性脂肪酸的比例。添加一些植物精油对挥发性脂肪酸的比例会产生不理想的改变，总挥发性脂肪酸的浓度未变而丙酸比例下降[22]。植物精油和它们的活性成分对挥发性脂肪酸比例的影响与pH值有关。桂皮提取物和它的主要活性成分肉桂醛在pH值7.0时，提高乙酸/丙酸，pH值为5.5时，降低乙酸/丙酸[23]。3.2松针与苜蓿混合青贮对育肥羔羊瘤胃微生物多样性的影响Alpha多样性反映微生物物种丰度及均匀度。Chao1指数和Observed species指数越大，群落的丰富度越高。Shannon指数和Simpson指数越高，群落的多样性越高。瘤胃微生物多样性受多方面的影响，日粮组成是影响瘤胃微生物的主要因素。本试验结果表明，苜蓿混合青贮中松针比例低于30%时，对羔羊瘤胃微生物群落多样性无影响；松针比例达30%时，可降低瘤胃细菌丰富度；混合青贮中松针比例增加，抑菌物质含量升高，抑菌作用增强，导致瘤胃细菌丰富度降低。Goods coverage越高，样本中未被检测出的物种所占的比例越少。试验组覆盖率均在97%以上，每个样品的测序量合理，能够较好地反映瘤胃细菌群落的丰富度和多样性。研究表明，在反刍动物瘤胃内，拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群[24-25]，在反刍动物瘤胃微生物中起重要作用。本试验研究表明，试验组丰度较高的菌门依次是拟杆菌门、厚壁菌门、互养菌门和变形菌门。在门水平上，试验组拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度在占总菌门的90%以上。有研究指出，日粮中高水平单宁可抑制瘤胃微生物的活动，单宁处理会降低瘤胃内拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度[26-27]，与本试验结果一致。随松针比例的升高，松针单宁增加，厚壁菌门相对丰度降低。厚壁菌门细菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代谢酶，促进机体对能量的吸收，利于脂肪的沉积[28]。本研究表明，饲喂30%松针和苜蓿混合青贮组厚壁菌门相对丰度显著低于10%玉米粉与苜蓿混合青贮组，苜蓿混合青贮中松针比例过高可抑制羔羊对养分的消化利用。从动物反刍物中分离出的互养菌能够以精氨酸和组氨酸作为底物，降解动物饲料中的毒素，帮助动物生存[29]。本试验表明，随苜蓿混合青贮中松针比例增加，互养菌门相对丰度逐渐升高。松针的抑菌成分对互养菌门无抑制作用。从属水平分析，普雷沃氏菌属和产琥珀酸菌属，试验组相对丰度较高。普雷沃氏菌属隶属于拟杆菌门，具有降解蛋白质、小肽、多糖等多种代谢产物的能力[30-31]。研究表明，普雷沃氏菌属为反刍动物瘤胃内的优势菌群[32-33]。本试验中，普雷沃氏菌属在各试验组占据优势地位。混合青贮中松针比例升高，瘤胃内普雷沃氏菌属相对丰度下降。松针比例增加，提高单宁水平，单宁可以抑制瘤胃蛋白降解细菌的生长[34]。产琥珀酸菌可将瘤胃中的琥珀酸盐转化为丙酸，丙酸是反刍动物合成葡萄糖的前体物质[35]。本试验中，10%玉米粉与苜蓿混合青贮组产琥珀酸菌属相对丰度高于其余各组，饲喂羔羊松针和苜蓿混合青贮可降低产琥珀酸菌属相对丰度，松针中的杀菌物质对产琥珀酸菌有抑制作用。瘤胃球菌属是瘤胃中的纤维降解菌，相对丰度在瘤胃微生物中仅占很小比例[36]，与本试验结果一致。单宁可抑制微生物对植物细胞壁的分解[37]。本试验中，随松针添加水平的升高，瘤胃球菌属相对丰度逐渐下降，松针单宁对瘤胃球菌产生抑制作用。4结论本研究表明，与饲喂玉米粉与苜蓿混合青贮相比，饲喂30%松针与苜蓿混合青贮可显著降低羔羊瘤胃氨态氮和丙酸浓度，提高乙酸/丙酸，降低瘤胃内菌群丰度，影响反刍动物的生产性能。羔羊日粮中松针占苜蓿混合青贮的比例建议低于30%。