抗生素作为饲料添加剂可以促进家畜的健康生长，提高生产性能[1-2]，一些植物提取物或次生代谢物具有类似作用。在饲料中添加次级代谢产物可以提高饲料资源的利用率，改善饲料质量，降低饲养成本。在瘤胃管理中利用次级代谢产物提高瘤胃微生物活性[3]，通过调控瘤胃微生物群落可以提高饲料利用效率[4]。天然草本产品合成抗菌化合物可以保护机体免受微生物损伤[5-6]，减少动物在进食过程中的异常行为，能够摄入更多的饲料[7]。大蒜副产物包括大蒜素、蒜氨酸、二烯丙基硫醚等[8]活性物质。蒜瓣被破坏后，蒜氨酸烷基磺酸裂解酶与蒜氨酸发生接触，生成大蒜素[6]。大蒜素具有抗菌和抗氧化活性[9]，在饲料中添加大蒜粉可以改变微生物菌群，减少甲烷排放，提高饲料利用率[10]。Kamruzzaman等[11]认为，饲喂大蒜茎叶青贮饲料可以提高羊对氮和能量的利用率，而不会抑制瘤胃发酵。Huang等[12]研究表明，添加大蒜素的日粮可以降低断奶仔猪腹泻发生率。Redoy等[13]研究发现，饲喂大蒜叶能够提高羊血清免疫球蛋白浓度、抗氧化能力和瘤胃乳头大小，提高生产性能，降低体内的自由基。目前，补充大蒜素对小尾寒羊行为、生理、瘤胃发酵的研究较少。本试验旨在研究大蒜素对小尾寒羊的行为、生长性能、瘤胃发酵、血清抗氧化等指标的影响，为大蒜素在羊生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物及试验设计试验于2021年1月20日至2021年5月1日在临沂大学（北纬35°11.36′，东经118°27.6′，海拔82 m）进行。将14只120日龄、体重（25.77±1.45）kg的小尾寒羊，随机分为2组，每组7个重复。预试期10 d，正式试验期100 d。对照组精料中不添加大蒜素；试验组（大蒜素组）精料中添加7.5 g/kg大蒜素（加易加生物科技有限公司），机器搅拌均匀，密封避光保存。精料组成及营养水平见表1。每天8：00和17：00分别向动物提供2次饲粮，先精后粗，粗料为花生秧，试验羊自由饮水。每天下午清洁圈舍1次，每周消毒1次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T001表1精料组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100玉米51粗蛋白/%9.57豆粕27粗脂肪/%8.62麸皮15粗灰分/%8.97盐1中性洗涤纤维/%42.33小苏打1酸性洗涤纤维/%28.89预混料5钙/%1.96磷/%0.13代谢能/(MJ/kg)10.64注：1.预混料为每千克精料提供：VA 1 367 IU、VD 194 IU、VE 15 IU、铁74 mg、锌46.3 mg、锰36.5 mg、铜17.0 mg、碘1.5 mg、硒0.3 mg。2.营养水平均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1采食行为和日常行为的评价在饮食适应后的0~2 d、40~42 d和80~82 d，对绵羊进行9个24 h的视频采集，评估饲养行为和日常行为。每个试验期间每天观察4 h，确定躺、站立、行走、反刍和休息的频率。每个试验期的4 h内观测视频收集摄食行为数据，确定采食时间和频率。1.2.2生长性能在第0 d和80 d对小尾寒羊称重，计算平均日增重和料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)料重比=平均日采食量/平均日增重(2)1.2.3胴体性状试验结束后，试验羊禁食24 h，自由饮水。按照标准商业程序（NY 467—2001）对羊进行人道击晕和屠宰，记录肝、心、脾、肺和肾的重量，用于评估器官重量百分比。根据NY 1236—2006的方法测定背膘厚度和眼肌面积。相对空体重的器官重量百分比=(器官重量/空体重)×100％[14] (3)1.2.4瘤胃发酵参数、瘤胃微生物组在数据收集期的第100 d，屠宰后使用无菌管收集瘤胃液样本。样品采集后立即用便携式pH计（Mettler Toledo S2，Zurich，Switzerland）监测瘤胃pH值。将瘤胃内容物通过两层纱布过滤，然后在-80 °C下冷冻，用于稍后测定挥发性脂肪酸（VFA）、氨态氮和瘤胃微生物。气相色谱仪的操作条件为：DB-FFAP柱30 m×250 μm（内径）×0.25 μm膜厚（Agilent custom HP-5，CA，USA）；载气为高纯氮气（99.999%）流速0.8 mL/min；辅助气体为高纯氢气（99.999%）；检测器FID温度280 ℃；进样口温度250 ℃；进样量：1 μL（脉冲分流模式，进样压力0.172 MPa×0.3 min，分流比50∶1；柱箱温度变化：以20 ℃/min的速率从60 ℃升高至220 ℃（保持1 min）。氨态氮（NH3-N）的测定按照宁夏化学分析检测协会（T/NAIA 004—2020）所述方法进行。使用DNA试剂盒（天根生物科技有限公司），根据说明书从瘤胃液样品中提取微生物群落基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上检查DNA提取物，使用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，USA）验证DNA浓度和纯度。使用ABI GeneAmp® 9700 PCR热循环仪（ABI，CA）使用引物对338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA基因的高变区V3-V4进行扩增。PCR热循环为98 ℃预变性2 min（1个循环），95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃单次延伸27个循环10 min，4 ℃结束。将获得的扩增产物在Illumina MiSeq PE300平台/NovaSeq PE250平台（Illumina，San Diego，USA）上进行测序。1.2.5血清指标在第0 d和第80 d的中午，将颈静脉血液样本放入真空管中（不含抗凝剂）。试管在3 500×g、4°C离心10 min，得到血清-80 °C保存。血清总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）使用酶标仪（Synergy HTX，BioTek，美国）和试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、生长激素（GH）、游离三碘甲状腺氨酸（FT-3）、游离甲状腺素（FT-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和尿素氮（BUN)使用ELISA试剂盒（上海裕平生物科技有限公司）测定。1.3数据统计与分析采用Excel 2006对数据进行统计分析，SPSS 26.0独立样本t检验检验组内检验试验前后的差异显著性，单因素方差分析各组间的差异显著性。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1大蒜素对小尾寒羊生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，大蒜素组小尾寒羊的平均日采食量显著增加（P0.05），料重比显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T002表2大蒜素对小尾寒羊生长性能的影响项目初重/kg末重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]平均日采食量/[kg/(头·d)]料重比P值0.3900.7270.1940.0170.028对照组27.071±2.78049.251±3.8500.221±0.0201.904±0.050b9.081±0.866a大蒜素组24.471±0.88050.900±2.5400.264±0.0202.014±0.040a7.908±0.590b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表9与此同。2.2大蒜素对小尾寒羊胴体性状的影响（见表3）由表3可知，大蒜素组小尾寒羊背最长肌面积有增加的趋势，大蒜素显著提高了小尾寒羊皮下脂肪厚度（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T003表3添蒜素对小尾寒羊胴体性状的影响项目活重/kg胴体重/kg屠宰率/%背最长肌面积/cm2背膘厚度/mmP值0.8410.7950.7870.0970.006对照组50.97±5.9825.35±3.1149.71±1.3713.65±1.593.53±0.19B大蒜素组52.40±5.9626.27±1.0950.22±1.0919.55±2.214.97±0.17A2.3大蒜素对小尾寒羊器官发育的影响（见表4）由表4可知，对照组和大蒜素组小尾寒羊的肝、脾、肺、肾等器官的质量及活重占比均无显著差异（P0.05），大蒜素组小尾寒羊心脏的活重占比有升高的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T004表4大蒜素对小尾寒羊器官发育的影响组织项目对照组大蒜素组P值心重量/kg0.196±0.0200.175±0.0120.430活重占比0.387±0.0200.333±0.0060.066肝重量/kg0.688±0.0730.635±0.0520.592活重占比1.362±0.0941.210±0.0450.221脾重量/kg0.049±0.0020.041±0.0040.214活重占比0.099±0.0140.077±0.0040.219肺重量/kg0.539±0.0570.473±0.0200.344活重占比1.087±0.1620.905±0.0290.333肾重量/kg0.121±0.0080.123±0.0060.911活重占比0.241±0.0120.234±0.0020.628注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）；相同字母或无字母表示差异不显著；表5、表6与此同。2.4大蒜素对小尾寒羊瘤胃发酵参数的影响（见表5）由表5可知，大蒜素对小尾寒羊瘤胃pH值、挥发性脂肪酸和NH3-N浓度无影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T005表5大蒜素对小尾寒羊瘤胃发酵参数的影响项目对照组大蒜素组P值pH值7.433±0.0667.266±0.0880.206氨态氮/(mg/100 mL)16.128±3.37015.704±2.0050.919乙酸/(mg/L)52.566±16.00846.745±9.2880.769丙酸/(mg/L)16.145±4.016216.332±3.0030.972异丁酸/(mg/L)12.335±5.42511.338±2.5770.876丁酸/(mg/L)100.821±30.004129.926±55.9010.670异戊酸/(mg/L)21.063±4.12522.024±3.0400.860戊酸/(mg/L)41.307±3.89939.989±2.8870.799乙酸/丙酸3.158±0.1972.847±0.0490.2012.5大蒜素对小尾寒羊采食行为和日常行为的影响（见表6）由表6可知，日粮中添加大蒜素显著降低了小尾寒羊采食频次和站立频次（P0.05），显著提高了反刍频率（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T006表6大蒜素对小尾寒羊采食行为和日常行为的影响项目对照组大蒜素组P值采食时间/(min/d)167.833±5.135158.500±8.8130.374采食频次/(次/d)67.333±3.703a55.416±3.630b0.035站立频次/(次/d)14.250±1.839a7.370±1.209b0.007行走频次/(次/d)8.500±0.8869.000±1.6250.791卧息频次/(次/d)73.750±9.20385.125±3.5270.268反刍频次/(次/d)37.000±5.348b51.000±3.453a0.045观望频次/(次/d)25.750±2.56133.750±4.9190.171饮水频次/(次/d)1.250±0.4530.750±0.36590.4052.6大蒜素对小尾寒羊血清生化指标的影响（见表7）由表7可知，大蒜素能够显著提高小尾寒羊血清GH、FT3和FT4水平（P0.05），但组间差异不显著（P0.05）。大蒜素能够提高小尾寒羊血清IgG和IgM含量（P0.05）水平，但组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T007表7大蒜素对小尾寒羊血清生化指标的影响项目时间/d对照组大蒜素组GH/(μg/L)04.46±8.44Ab4.96±4.51Ab808.63±8.01Aa8.49±5.82AaFT3/(pmol/L)011.32±0.83Ab11.26±0.62Ab8013.9±0.71Aa13.29±0.83AaFT4/(pmol/L)016.09±0.51Aa14.09±0.81Ab8017.88±0.54Aa19.87±1.49AaBUN/(mmol/L)017.87±0.81Aa18.33±0.42Aa8020.02±0.83Aa22.75±0.72AaTNF-α/(ng/L)098.81±10.81Aa109.10±7.29Aa8095.09±13.20Aa102.5±12.71AaIL-6/(ng/L)071.45±6.13Aa61.84±4.28Aa8070.45±3.88Aa64.31±2.98AaIL-1β/(ng/L)039.61±6.13Aa43.70±4.28Aa8047.23±3.88Aa49.17±2.98AaIgM/(mg/L)01 021.41±81.35Ab1 227.41±69.05Ab801 546±120.03Aa1 636.22±107.08AaIgG/(g/L)023.44±1.30Ab27.91±1.11Ab8033.09±3.84Aa37.04±4.09Aa注：同行数据肩标大写字母不同表示组间差异显著（P0.05），同列同项目数据肩标小写字母不同表示不同时间差异显著（P0.05）；表8与此同。2.7大蒜素对小尾寒羊血清抗氧化指标的影响（见表8）由表8可知，大蒜素能够显著提高小尾寒羊血清中SOD、T-AOC活性（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T008表8添加大蒜素对小尾寒羊血清抗氧化指标的影响项目时间/d对照组大蒜素组MDA/(μmol/L)09.37±0.62Ab16.25±2.60Aa8017.50±3.22Aa15.62±0.62AaSOD/(U/mL)011.91±1.15Ab14.33±0.31Ab8015.37±0.19Ba16.45±0.36AaT-AOC/(mol/L)04.31±0.43Aa4.16±0.29Aa803.70±0.35Ba4.93±0.25AaGSH-Px/(μmol/L)0121.08±48.13Aa172.04±25.13Ab8093.97±9.75Aa87.83±12.49AaCAT/(U/mL)017.16±0.18Aa15.79±0.96Aa8017.06±0.10Aa15.76±0.49Ba2.8大蒜素对细菌多样性及瘤胃细菌组成的影响（见表9、图1）通过筛选，共获得301 036个细菌16S RNA基因序列，平均每个样本分析了50 172个序列。由表9可知，ACE、Chao 1、Simpson多样性指数和Shannon多样性指数未发现显著性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.T009表9添加大蒜素对瘤胃液中细菌多样性和组成的影响项目ACE指数Chao 1指数Shannon指数Simpson指数对照组1 299.33±58.081 304.91±62.005.41±0.230.015±0.005大蒜素组1 270.09±46.961 264.18±53.485.35±0.110.014±0.002由图1可知，按照97%的序列相似性，不同处理组共有1 663个OTUs，两组中存在1 414个共有的OTU，而对照组和大蒜素组中分别鉴别出139、110个独特的OTU。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.F001图1Venn图2.9细菌多样性与瘤胃发酵参数的相关性分析（见图2）由图2可知，假杆菌属与瘤胃液中乙酸、丙酸、异丁酸和A/P呈正相关。Prevotellaceae_UCG-003与异戊酸呈正相关。nk4a214_genus组与pH值呈正相关。norank_f__norank_o__absconditabbacteriales_sr1与瘤胃液中异缬酸、异丁酸（P0.01）、乙酸和丙酸呈负相关。脱硫弧菌属与醋酸和丙酸呈负相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.001.F002图2瘤胃发酵参数与细菌属相对丰度的相关性3讨论3.1大蒜素对小尾寒羊生长性能和胴体性状的影响本研究表明，添加大蒜素能够提高小尾寒羊的平均日采食量，改善料重比。Ahmed等[15]研究发现，大蒜和柑橘提取物的混合物有更高的平均日摄入量。在饵料中添加大蒜素可以通过促进肠道菌群的生长来提高鲟鱼生长过程中的饲料效率[16]。Redoy等[13]研究发现，大蒜叶可以提高饲料转化率。饲粮补充大蒜素显著影响猪的日增重[12]。Samolińska等[17]研究表明，与对照组相比，在整个试验期内，添加大蒜素的试验组表现出更高的饲料转化率，并在育肥期的开始和生长阶段提高日增重；大蒜素组羊胴体性状与对照组差异不显著，但皮下脂肪厚度差异显著。本研究结果表明，补充大蒜素可以改善皮下脂肪厚度。冷冻干燥的大蒜有助于减少肩胛骨上测量的背脂厚度[17]。本研究中，除了心脏占活重的百分比外，所有器官发育指标均无显著差异，与上述研究结果一致，如大蒜精油不影响器官发育[18]，补充大蒜油仅会影响肉鸡的相对器官重量[19]。因此，饲喂大蒜素对绵羊和肉鸡的生长发育可能无显著影响。3.2大蒜素对细菌多样性和挥发性脂肪酸的影响本试验未得到大蒜素影响瘤胃细菌组成和细菌多样性的任何证据，但本研究发现细菌属与瘤胃发酵参数之间存在一定的相关性。假单胞菌与异丁酸、醋酸、丙酸、A/P相关。假单胞菌包括产醋酸菌和产丙酸菌[20]。微生物变化影响反刍和进餐时间，在饲粮添加酵母的情况下，奶牛也倾向于更长的反刍期和更多的用餐时间，因为添加酿酒酵母可以通过促进瘤胃微生物的持续生长和减少乳酸的产生来稳定瘤胃pH值[21]。但在Cardozo等[22]研究发现，大蒜提取物不能影响总VFA浓度、醋酸、丙酸或丁酸的浓度。3.3大蒜素对采食行为和日常行为的影响饮食可能通过胃肠道系统、微生物区系和中枢神经系统之间的通信网络调节动物的行为[23]。本研究中，补充大蒜素的动物反刍率高于对照组。Ahmed等[15]研究发现，对照组的采食频率较低，但大蒜提取物能够提高反刍率，增加绵羊的体重。本研究发现，对照组饲喂时间和次数均高于大蒜素组，但大蒜素组反刍率显著高于对照组，说明喂食大蒜素可能会提高羊的进食速度；喂大蒜素可以提高饲料转化效率。研究表明，大蒜素可以提高营养物质的消化率[24]。饲喂大蒜素可以显著降低绵羊的站立频率，低站立频率可以减少能量损失，促进生长。3.4大蒜素对小尾寒羊血清免疫指标的影响大蒜素可以通过氧化应激、免疫反应和炎症反应在免疫系统中发挥作用[25]。大蒜提取物补充剂可能有助于缓解炎症反应[26]。大蒜可以增强Labeo Rohita鱼种的天然免疫功能[27]。血清中的肿瘤坏死因子α在巨噬细胞的免疫调节中起重要作用[28]。白细胞介素在传递信息、激活和调节免疫细胞以及介导T和B细胞的激活、增殖和分化方面起重要作用[29]。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-1β是激活NF-κB和MAPK途径的主要促炎细胞因子[30]。本研究发现，大蒜素不能减轻绵羊的炎症反应，大蒜素有降低血清IL-6的趋势，可能添加的大蒜素剂量不足以降低炎症反应。本研究未发现大蒜素对生长激素、FT-3、FT-4和BUN的影响。但是一些指标显示大蒜素倾向于改善绵羊的生长，可能是因为大蒜素的浓度不足以使血清激素浓度改变达到统计学意义。3.5大蒜素对血清激素和抗氧化性能的影响当动物患病或面临环境压力时，就会产生活性氧。当活性氧的产生与动物的抗氧化能力不平衡后，就会导致氧化应激[31]。氧化应激通常被认为是动物疾病的主要原因[32]。总抗氧化能力和超氧化物歧化酶是评价动物氧化状态的主要指标[33]，SOD是机体清除氧自由基的重要抗氧化物，T-AOC是机体抗氧化能力的综合性指标。本研究结果表明，大蒜素可通过提高超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力来提高机体的抗氧化能力。4结论日粮中添加大蒜素能够影响小尾寒羊采食行为和日常行为，促进生长，增强其抗氧化能力，对瘤胃微生物和瘤胃发酵具有一定的影响。