微生态制剂是一种可以促生长的物质，主要是由益生菌或帮助益生菌生长的物质制成[1]。将微生态制剂添加入动物日粮中，可达到类似抗生素的效果。微生态制剂是一种绿色、环保对动物机体无公害的制剂[2]。枯草芽孢杆菌（BS）是一种可利用蛋白质和多糖的益生菌[3]，可以产生多种酶类化合物，从而改善细胞生长特性、抵抗应激能力以及增强机体抵抗力[4]。Zhang等[5]研究发现，在肉鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高肉鸡42日龄体重、平均日增重和饲料转化率。朱沛霁[6]研究表明，枯草芽孢杆菌进入动物肠道后，可产生抗菌肽等物质，增强机体的体液免疫和肠道黏膜免疫和沙门氏菌的杀灭效果，促进乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌繁殖。地顶孢霉培养物（ATC）是一种可以代替抗生素的中草药饲料添加剂，具有提高生长性能、机体免疫力和防止疾病发生等作用[7]。冯柳柳等[8]报道，地顶孢霉培养物能够提高AA肉鸡生长性能、免疫功能及抗氧化能力。粟元文等[9]研究发现，在AA肉鸡日粮中添加0.2%地顶孢霉培养物可以提高肉鸡生长性能，改善免疫功能。枯草芽孢杆菌和地顶孢霉培养物单独使用，对肉鸡生长性能以及免疫功能的影响已有报道，但两者组合使用在白羽肉鸡生产中的应用尚未见报道。因此，本试验通过将不同剂量的微生态制剂添加至叠层笼养白羽肉鸡日粮中，研究其对肉鸡生长性能、血清抗体、生化指标以及复合排泄物中有害气体含量的影响，以期为微生态制剂在叠层笼养白羽肉鸡养殖生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料微生态制剂（曼安宁）主要成分为枯草芽孢杆菌（KW119）、地顶孢霉培养物（虫草素、虫草酸和虫草多糖），由辽宁凯为生物技术有限公司提供，批号TY1107。枯草芽孢杆菌活性为2×108 CFU/g。主要试剂：新城疫病毒抗原（批号20191019），购自青岛易邦生物工程有限公司；H9亚型禽流感病毒抗原（批号20200724），购自青岛易邦生物工程有限公司）；1%鸡红细胞悬液（自制）；生化测定试剂盘（批号921626）购自成都普利泰生物科技有限公司。主要仪器：96孔V型微量板、微型振荡器、TD4Z-WS医用离心机（湖南湘鑫仪器仪表有限公司）、HYE2000-NH3泵吸式氨气检测仪（台州汉遥电子科技有限公司）、HYE2000-H2S泵吸式硫化氢检测仪（台州汉遥电子科技有限公司）、SMT-120VP全自动生化分析仪（成都斯玛特科技有限公司）。1.2试验设计试验选取1日龄体重接近、健康的白羽肉鸡300只（公、母各半）。试验在辽宁凯为养殖基地进行，采用完全随机分组试验设计，随机分为3组，每个组5个重复，每个重复20只白羽肉鸡，分笼饲养，每个笼有限面积为1 m2（肉鸡笼为白羽肉鸡养殖专用笼，面积为1.25 m×0.8 m）。对照组（T0组）为基础日粮，试验组（T1组和T2组）分别在基础日粮中添加0.02%和0.05%剂量的微生态制剂。试验期42 d。基础日粮参照NRC（1994）[10]肉仔鸡营养需要进行配制。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成/%1~21 d22~42 d营养水平1~21 d22~42 d合计100.00100.00玉米60.4064.05代谢能/(MJ/kg)12.1412.51豆粕34.4030.00粗蛋白质/%21.1719.24磷酸氢钙1.401.30有效磷/%0.380.36石粉1.211.12赖氨酸/%1.291.15氯化钠0.250.25蛋氨酸/%0.670.48大豆油1.002.00蛋氨酸+半胱氨酸/%1.000.72氯化胆碱0.050.05钙/%0.920.87赖氨酸0.080.10DL-蛋氨酸0.210.13预混料1.001.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 5 000 IU、VD 1 000 IU、VB1 9.8 mg、VB2 28.8 mg、VB6 19.6 mg、VB12 0.1 mg、VE 75.0 IU、VK3 18.8 mg、Zn 37.6 mg、Fe 40.0 mg、I 0.2 mg、Cu 4.0 mg、Mn 50.0 mg、Se 0.2 mg、生物素2.5 mg、D-泛酸58.8 mg、烟酸196.0 mg、叶酸4.9 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验鸡在密闭控温鸡舍的小群体肉鸡专用笼饲养，自由采食和饮水，每天观察试验鸡的健康状态。试验鸡在7日龄分别进行新城疫疫苗和禽流感疫苗免疫，21日龄新城疫疫苗饮水免疫。试验鸡饲养管理、免疫规程和鸡舍卫生管理均按白羽肉鸡饲养规程进行。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验期内每天以重复为单位记录试验鸡采食量，分别于试验鸡1日龄、21日龄和42日龄时早上对试验鸡进行空腹称重，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G），记录鸡只剩余数量计算成活率。ADG＝(末重－初重)/试验天数(1)ADFI＝(供料量－剩料量)/试验天数(2)F/G=ADFI/ADG(3)成活率=活鸡数/总数×100%(4)1.4.2血清抗体和生化指标试验结束，从42日龄、每个重复组内选取接近该重复平均体重的试验鸡，翅下静脉采血4 mL，制备血清。采集的血液样品室温静置30 min，1 200 r/min离心15 min，取上层血清，-80 ℃冰柜中冷冻保存，用于测定血清抗体和生化指标。新城疫和禽流感H9抗体检测参照GB/T 16550—2020《新城疫诊断技术》[11]、GB/T 18936—2020《高致病性禽流感诊断技术》[12]中规定的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术。生化指标采用全自动生化分析仪测定血清样品中白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、球蛋白（GLOB）、白球比（A/G）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）含量。1.4.3复合排泄物中有害气体42日龄试验结束，每个重复取500 g鸡复合排泄物样品（粪便和尿液混合物），放-21 ℃冰柜中冷冻留存，用于测定复合排泄物中有害气体NH3和H2S含量。复合排泄物解冻，混匀，取500 g复合排泄物置于2 L密封塑料盒，塑料盒侧面有个小孔，胶带密封。25 ℃室温发酵24 h，复合排泄物样品小孔处2 cm采集100 mL空气，小孔采用胶带密封发酵，每个重复进行3次NH3和H2S排放量测量。测量前，人工摇晃样品30 s，破坏复合排泄物样品表面的结皮形成，使样品混匀。NH3和H2S的浓度在5.00~100.00 mg/m3范围内测量[13]。1.5数据统计与分析数据采用Excel进行整理，SPSS 17.0程序中LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1微生态制剂对白羽肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，与T0组相比，T1组显著提高了肉鸡21日龄体重（P0.05）；在1~21日龄试验期内，与T0组相比，T1组显著提高了1~21日龄ADG（P0.05）；在22~42日龄试验期内，与T0组相比，T1组显著提高了ADFI（P0.05）；在1~42日龄试验期内，与T0组相比，T1组显著降低了F/G（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T002表2微生态制剂对白羽肉鸡生长性能的影响项目T0组T1组T2组1 d体重/g44.77±0.2344.88±0.1944.88±0.1521 d体重/g911.31±18.83b941.46±18.01a919.68±18.61ab42 d体重/g2 578.26±71.882 654.38±76.082 488.47±73.551~21 dADG/[g/(只·d)]41.26±0.89b42.69±0.86a41.66±0.88abADFI/[g/(只·d)53.60±1.3454.92±1.5153.93±1.37F/G1.30±0.011.29±0.011.29±0.0122~42 dADG/[g/(只·d)79.38±2.8281.57±3.1174.71±3.37ADFI/[g/(只·d)141.11±3.22Ab143.25±3.79a135.35±3.46BF/G1.78±0.03ab1.76±0.03b1.81±0.04a1~42 dADG/[g/(只·d)60.32±1.71AB62.13±1.81A58.18±1.75BADFI/[g/(只·d)99.79±2.13AB101.11±1.84A97.56±1.80BF/G1.66±0.02a1.63±0.02Bb1.68±0.02A存活率/%0.90±0.04ab0.92±0.03a0.86±0.04b注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2微生态制剂对白羽肉鸡血清抗体的影响（见表3）由表3可知，整个试验期（1~42日龄），与T0组相比，T1组显著提高了肉鸡血清中新城疫病毒抗体效价（P0.05）；T1组极显著提高了血清中H9亚型禽流感病毒抗体效价（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T003表3微生态制剂对白羽肉鸡血清抗体的影响项目T0组T1组T2组新城疫病毒抗体效价3.60±0.89a5.20±0.84b4.00±1.00abH9亚型禽流感病毒抗体效价2.80±0.84A4.80±0.84B2.40±0.55Alog22.3微生态制剂对白羽肉鸡血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，整个试验期（1~42日龄），与T0组相比，T1组显著提高了肉鸡血清中ALB、TP和GLOB含量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T004表4微生态制剂对白羽肉鸡血清生化指标的影响项目T0组T1组T2组ALB/(g/L)12.90±1.56b15.14±0.95a13.10±1.17bTP/(g/L)33.28±4.17b39.24±3.21a34.74±3.68abGLOB/(g/L)20.38±2.71b24.10±2.40a21.64±2.62abA/G0.63±0.030.63±0.040.61±0.04BUN/(mmol/L)1.27±0.091.21±0.061.22±0.09GLU/(mmol/L)12.48±0.9511.81±0.7511.81±0.762.4微生态制剂对白羽肉鸡排泄物中有害气体的影响（见表5、表6）由表5可知，与T0组相比，复合排泄物发酵6 h和12 h后，T1组极显著降低了复合排泄物中H2S排放量（P0.01）；发酵24 h后，与T0组相比，T1组显著减低了复合排泄物中H2S排放量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T005表5微生态制剂对白羽肉鸡复合排泄物中H2S的影响发酵时间/hT0组T1组T2组68.68±0.40A7.62±0.75B8.09±0.28AB1232.20±0.89A27.03±1.52B32.61±0.60A2443.63±1.36a41.24±1.41b43.72±1.66amg/m3由表6可知，与T0组相比，复合排泄物发酵6 h后，T1组和T2组均极显著减低了复合排泄物中NH3排放量（P0.01）；复合排泄物发酵12 h和24 h后，与T0组相比，T1组极显著减低了复合排泄物中NH3排放量（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.009.T006表6微生态制剂对白羽肉鸡复合排泄物中NH3的影响发酵时间/hT0组T1组T2组615.52±0.49A7.60±0.39B13.49±0.52C1235.18±1.81A28.57±1.65B34.90±1.16A2464.17±3.48A55.44±3.68B65.89±2.31Amg/m33讨论3.1微生态制剂对白羽肉鸡生长性能的影响ADG、ADFI和F/G是衡量生长性能的重要指标，直接影响着规模化养殖场的经济效益。本研究发现，枯草芽孢杆菌和地顶孢霉培养物混合使用能够有效提高白羽肉鸡1~21日龄的生长性能，降低1~42日龄F/G。Wealleans等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌能够提高动物胃肠道内酶的活性，而且为胃肠道内多种酶制剂的重要来源，能够增强动物对饲料的消化吸收。闫一博等[15]研究发现，肉鸡日粮中枯草芽孢杆菌（KG109）使用量为0.9%时，能够显著降低肉鸡F/G。Gao等[16]研究表明，在肉鸡日粮中添加200 mg/kg枯草芽孢杆菌添可改善1~42日龄肉鸡的生长性能，提高饲料利用率，减少肠道内有害菌。邵紫培等[17]研究发现，肉鸡日粮中添加0.1%或0.2%冬虫夏草菌粉饲能够提高肉鸡的生长性能和免疫功能。赵乐乐等[18]研究发现，虫草粉饲料添加剂能够促进芦花鸡早期生长发育。刘磊等[19]研究表明，枯草芽孢杆菌在改善肉仔鸡生长性能方面的效果在生长前期比后期更强。3.2微生态制剂对白羽肉鸡血清抗体的影响抗体指由抗原刺激产生的具有保护作用的免疫球蛋白，通过对疫苗免疫后的抗体效价检测反应疫苗的免疫效果[20]。本试验发现，由枯草芽孢杆菌和地顶孢霉培养物制成的微生态制剂，白羽肉鸡血清中新城疫病毒抗体和H9亚型禽流感病毒抗体显著提高。田奎等[21]研究表明，合理使用中草药饲料添加剂，可以代替抗生素并达到与抗生素类似的效果，如提高畜禽生长性能，抗病菌和病毒，改善机体免疫能力等。鹿晓慧等[22]研究表明，在蛋鸡日粮中添加0.1%的微生态制剂能够提高禽流感（H7N9）的抗体效价。刘海峰[23]研究发现，借助黄芪、当归、板蓝根和党参等中草药制剂的作用，可以提高机体新城疫病毒抗体和禽流感病毒抗体水平，达到预防病毒感染的效果。本试验前期预试验研究发现，白羽肉鸡遭受野毒感染，日粮中添加微生态制剂的白羽肉鸡可有效降低感染风险，降低死亡率。3.3微生态制剂对白羽肉鸡血清生化指标的影响总蛋白及其组分水平的评估为解释脱水、感染、免疫疾病和炎症反应的发生提供必要的信息，血清蛋白与体重和蛋白质合成呈正相关[24]。本试验结果表明，微生态制剂可以显著提高血清中ALB、TP和GLOB含量。许运岑等[25]报道，日粮中添加枯草芽孢杆菌可以显著提高AA+肉鸡血清中TP和GLOB含量，对血清中ALB含量影响不显著。崔宇[26]报道，饲喂适量的枯草芽孢杆菌的白羽肉鸡血清TP和GLOB含量显著提高。武杰等[27]报道，地顶孢霉培养物可提高肉羊血清中GLU、TP和ALB含量，能够促进肉羊生长发育。张永根等[28]报道，地顶孢霉培养物能够提高奶牛血清中ALB和GLOB含量。3.4微生态制剂对白羽肉鸡复合排泄物中有害气体排放量的影响氨和含硫化合物是造成家禽养殖场恶臭和环境污染问题的两种主要有害气体。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌和地顶孢霉培养物混合制成的微生态制剂可有效降低复合排泄物中有害气体排放量。Ferket等[29]认为，粪便气味和NH3排放与养分利用和肠道微生物生态系统有关。Han等[30]研究发现，益生菌可以通过改善肠道微生物生态、营养物质利用和饲料效率，间接减少动物粪便中的这些环境污染物。H2S是细菌硫酸盐在厌氧条件下还原、分解或同时分解含硫有机化合物所产生的最显著的挥发性硫[31]。大肠杆菌与假单胞菌、柠檬酸杆菌、气单胞菌和沙门氏菌是最有希望产生硫化氢的细菌[32]。Jeong等[33]在肉鸡日龄中添加枯草芽孢杆菌制剂后盲肠和排泄物中大肠杆菌和沙门氏菌数量得到降低，乳酸菌数量提高。程贵兰[34]研究表明，地顶孢霉培养物可以提高麒麟鸡盲肠内有益菌丰度，降低有害菌丰度。Chen等[35]研究发现，枯草芽孢杆菌可以降低病原微生物的繁殖，减少氨和H2S的排放。因此，枯草芽孢杆菌和地顶孢霉培养物能够通过影响肠道内微生物，减少大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌含量，达到减少粪便中有害气体排放量的效果。4结论叠层笼养白羽肉鸡日粮中添加由枯草芽孢杆菌（KW119）和地顶孢霉培养物为主要成分的微生态制剂，可以有效提高1~21日龄叠层笼养白羽肉鸡生长性能，提高42日龄白羽肉鸡血清中新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒抗体，明显提高血清中白蛋白、球蛋白和总蛋白含量，降低复合排泄物中有害气体的排放量。本试验条件下，微生态制剂添加量为0.02%时效果最佳。