维生素D（VD）可根据侧链结构的不同分为D2、D3、D4、D5、D6和D7等多种形式。动物体中发挥作用的主要是维生素D2（麦角钙化醇，VD2）和维生素D3（胆钙化醇，VD3）。VD可促进钙磷吸收，还能够调节机体的免疫反应，是一种重要的免疫调节剂[1]。人体VD水平与癌症[2-3]、高血压[4]、心血管疾病[5]、自身免疫性疾病[6]、糖尿病[7]、新冠肺炎[8-10]均存在不同程度的联系。缺乏VD3可导致骨骼异常，影响生长发育[11-13]。老年人和孕妇是VD缺乏症的高危人群，应通过饮食针对性补充[14-15]。我国居民VD缺乏现象尚未得到有效改善[16-19]。人体获取VD3主要通过食物获取及皮肤内7-脱氢胆固醇经阳光照射转化。营养强化食品是改善人体微量元素缺乏的重要途径之一[20]。VD3在家禽养殖中的应用主要集中于预防骨骼异常、改善肉鸡生长性能和肉品质、蛋鸡生产性能和蛋品质上[11-13]。本试验以散养芦花鸡为对象，在日粮中增加不同水平的VD3，探究其对鸡蛋中VD3、钙、磷含量和蛋品质的影响，为研究蛋鸡日粮中VD3的最适添加量、生产富VD3鸡蛋提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验于2020年11月—12月在天津市滨海新区金洼农业科技发展有限公司芦花鸡养殖基地进行。选用252只40周龄的芦花鸡，随机分为7组，每组36只。平地放养，每组活动区域50 m2，每天饲喂2次（每日8：00和14：00），提供充足清洁用水。第1组为对照组，饲喂基础日粮（VD3水平为3 600 IU/kg），第2~7组为试验组，日粮中VD3水平分别为6 600、9 600、15 600、27 600、51 600、99 600 IU/kg。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米60.0干物质/%≥86.00豆粕20.0粗蛋白/%≥16.50高粱5.0粗纤维/%≤5.50麸皮4.0钙/%2.75石粉4.0磷/%0.51鱼粉2.5骨粉2.5预混料2.0注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 30 000 IU、VB1 20 mg、VB2 40 mg、VB6 24 mg、VD3 800 IU、VE 20 mg、VK3 400 mg、铁0.7 g、铜0.008 g、锰0.3 g、锌0.8 g、碘2 mg、硒2 mg。2.营养水平中钙、磷为实测值，其余均为计算值。1.2试验材料1.2.1试剂VD3标准品（CAS号：67-97-0）购自中国食品药品检定研究院；维生素D3添加剂购自广东欧斯曼生物科技有限公司；钙标准溶液、磷酸二氢钾、钼酸铵均购自天津市光复科技发展有限公司；甲醇（色谱纯）购自默克股份两合公司；2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（色谱纯）、盐酸（优级纯）、偏钒酸铵、石油醚（分析纯，沸程30~60 ℃）均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钾、氯化钠、抗坏血酸均购自天津市汇杭化工科技有限公司；硝酸、高氯酸均为优级纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；pH值试纸等。1.2.2仪器与设备Agilent-1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、ICE-3000原子吸收光谱仪（赛默飞世尔科技公司）、UV-1100紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、FB223电子分析天平（上海舜宁恒平科学仪器有限公司）、XMT-DA恒温水浴锅（余姚市亚星仪器仪表有限公司）、分液漏斗振荡器（上海皓庄仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海予申仪器有限公司）、NFN382蛋白高度测定仪（日本FHK公司）、EG35A plus数控加热板（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）、TSS-QCR蛋壳颜色测定仪（北京天翔飞域科技有限公司）、BFJ009蛋形指数测定仪（日本FHK公司）、罗氏比色扇（瑞士Roche公司）等。1.3样品采集试验第10 、20、30 d，取20枚鸡蛋检测VD3水平，15枚测定蛋品质，12枚检测蛋黄、蛋清的钙、磷含量，6枚检测蛋壳的钙、磷含量。1.4测定指标及方法1.4.1高效液相色谱法测定蛋黄中VD3含量样品前处理参照GB 5009.82—2016，鸡蛋黄样品中加入一定量的氢氧化钾-乙醇溶液，80 ℃水浴皂化，石油醚萃取，超纯水水洗至中性，水浴蒸干，10 mL流动相充分溶解，有机滤膜滤过。高效液相色谱仪检测条件：流动相甲醇-水（体积比95∶5）、流速1.3 mL/min、检测波长264 nm、柱温35 ℃、进样量20 μL、色谱柱C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。1.4.2原子吸收光谱法测定蛋黄、蛋清、蛋壳中钙含量样品前处理参照GB 5009.82—2016，取蛋黄、蛋清于100 mL锥形瓶，加入高氯酸-硝酸（体积比1∶3），通风橱静置过夜，200 ℃加热消化至溶液澄清透亮，容量瓶定容。取蛋壳（去蛋壳膜）以盐酸-水（体积比1∶1）充分溶解，容量瓶定容。原子吸收光谱仪检测条件：波长422.7 nm、空气-乙炔流量1.4 L/min、灯电流5.25 mA、狭缝0.5 nm。1.4.3钼黄比色法测定蛋黄、蛋清、蛋壳中磷含量样品处理方法同1.4.2，钒钼酸铵显色试剂作供试液，紫外分光光度计测定供试液于400 nm处的吸光度。1.4.4蛋品质指标的测定参考王倩等[21]的方法测定蛋重、相对密度、蛋形指数、蛋清重、哈氏单位、蛋黄重、蛋黄颜色、蛋壳重、蛋壳颜色和蛋壳厚度等指标。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 25软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan's和Dunnett's T3法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮添加VD3水平对蛋黄VD3水平的影响（见图1）由图1可知，第10、20、30 d，试验5组、6组、7组蛋黄中VD3水平均显著高于对照组（P0.05）。试验第30 d时，试验7组蛋黄中VD3水平达到最高（135.24 IU/g），是对照组的4倍。结果表明，以高于3 600 IU/kg水平的VD3日粮饲喂蛋鸡，蛋黄中VD3富集在第10 d可达到饱和。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.F001图1日粮添加VD3水平对蛋黄VD3水平的影响注：字母不同表示差异显著（P0.05）；下图同。2.2日粮添加VD3水平对鸡蛋钙、磷含量的影响（见图2）由图2可知，与对照组相比，各试验组各时间段蛋黄中的钙、磷含量以及蛋壳中的磷含量均无显著差异（P0.05）；试验5组、6组、7组各时间段蛋清磷含量均显著提高（P0.05）。试验表明，日粮中增加VD3水平对蛋黄、蛋清和蛋壳中的钙含量、蛋黄和蛋壳中的磷含量均无显著影响，较高VD3水平可显著提高蛋清中磷含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.F002图2日粮添加VD3水平对鸡蛋钙、磷含量的影响2.3日粮添加VD3水平对各阶段鸡蛋蛋品质的影响（见表2~表4）由表2可知，试验第10 d，试验5组、6组、7组的蛋黄颜色均显著高于对照组（P0.05）；试验6组的蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重、蛋壳厚度均高于其他组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.T002表2日粮中添加VD3水平对第10 d鸡蛋蛋品质的影响项目对照组试验2组试验3组试验4组试验5组试验6组试验7组蛋重/g47.91±1.1147.57±1.0347.11±0.7647.24±1.0647.13±0.7950.51±0.8947.16±1.29蛋形指数1.41±0.021.40±0.011.38±0.021.39±0.021.38±0.011.38±0.011.36±0.02蛋壳颜色40.29±1.6542.91±1.6642.97±1.5542.97±2.1938.91±1.5241.11±1.5543.16±1.44相对密度/(g/mL)1.082±0.0031.088±0.0011.088±0.0011.084±0.0021.087±0.0031.087±0.0011.085±0.002蛋清重/g24.43±0.8825.34±1.0024.62±0.6524.77±0.8124.75±0.6626.69±0.7724.79±0.89蛋壳重/g5.93±0.136.08±0.226.02±0.176.05±0.215.98±0.146.27±0.185.90±0.26蛋黄重/g15.81±0.46ab15.40±0.43b15.50±0.47ab14.99±0.65b15.05±0.29b16.69±0.29a16.20±0.29ab哈氏单位82.9±2.3381.31±1.8883.07±1.7884.67±2.0081.52±1.2681.62±1.7086.36±1.54蛋黄颜色9.10±0.43c9.47±0.38bc9.78±0.40bc9.86±0.46bc10.30±0.26b10.33±0.16b11.43±0.27a蛋壳厚度/mm0.38±0.010.38±0.010.38±0.010.39±0.020.38±0.010.39±0.010.39±0.02注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表3可知，试验第20 d，试验7组的蛋黄颜色显著高于其他组（P0.05）；试验3组、4组、5组的蛋壳颜色显著低于试验7组（P0.05）；试验6组的蛋黄重为各组最高，显著高于试验4组（P0.05）；试验6组的蛋重为各组最高，显著高于试验2组、7组（P0.05）；各组间其他蛋品质指标差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.T003表3日粮添加VD3水平对第20 d鸡蛋蛋品质的影响项目对照组试验2组试验3组试验4组试验5组试验6组试验7组蛋重/g48.52±1.16ab47.31±0.97b48.42±0.95ab48.40±0.73ab49.14±0.58ab51.34±0.77a48.06±0.92b蛋形指数1.41±0.011.41±0.011.37±0.021.36±0.011.41±0.011.38±0.011.36±0.01蛋壳颜色36.54±1.64ab37.73±1.32ab33.38±1.03b33.38±2.16b33.29±0.81b34.16±1.62ab38.72±1.35a相对密度/(g/mL)1.083±0.0011.084±0.0011.084±0.0021.083±0.0021.085±0.0021.087±0.0011.082±0.001蛋清重/g25.75±0.8425.73±0.9125.83±0.5226.19±1.3426.30±0.6227.91±0.9225.97±0.63蛋壳重/g6.26±0.216.20±0.256.22±0.156.09±0.256.31±0.126.42±0.145.89±0.22蛋黄重/g15.14±0.51ab14.73±0.59ab15.64±0.54ab14.18±0.74b15.78±0.47ab16.12±0.58a15.64±0.39ab哈氏单位83.63±1.9287.40±1.1886.30±1.1988.40±3.2586.33±1.4483.95±2.3188.60±1.21蛋黄颜色8.00±0.17b8.08±0.26b8.00±0.18b8.29±0.18b8.00±0.13b8.36±0.15b11.93±0.32a蛋壳厚度/mm0.30±0.010.31±0.010.30±0.010.29±0.010.30±0.010.31±0.010.29±0.01由表4可知，试验第30 d，试验7组蛋黄颜色显著高于其余各组（P0.05），蛋壳颜色显著高于对照组（P0.05）；试验2组、4组、5组的蛋壳厚度均显著低于试验6组（P0.05）。结果表明，日粮中VD3水平提高至6 600~51 600 IU/kg时，对蛋品质指标均无负面影响；VD3水平提高至51 600 IU/kg，可提高蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重；VD3水平提高至96 600 IU/kg，可显著提高蛋黄颜色。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.008.T004表4日粮添加VD3水平对第30 d鸡蛋蛋品质的影响项目对照组试验2组试验3组试验4组试验5组试验6组试验7组蛋重/g48.68±0.6048.87±0.5246.93±1.7647.84±0.2949.57±0.4149.82±0.9348.51±1.05蛋形指数1.41±0.011.40±0.031.39±0.021.37±0.031.40±0.021.36±0.011.36±0.01蛋壳颜色33.58±1.22b37.46±2.01ab34.91±0.83ab37.70±0.65ab35.18±1.86ab37.65±2.57ab40.68±1.18a相对密度/(g/mL)1.081±0.0011.079±0.0031.084±0.0011.081±0.0031.086±0.0021.085±0.0011.083±0.002蛋清重/g24.52±0.7826.11±0.6424.76±1.0625.74±0.5326.46±0.4226.64±0.6925.87±0.81蛋壳重/g6.16±0.096.06±0.266.38±0.296.40±0.306.40±0.186.41±0.116.03±0.13蛋黄重/g16.29±0.4015.85±0.3515.56±0.7015.33±0.5616.46±0.1916.49±0.4516.15±0.34哈氏单位88.88±1.0586.5±3.388.06±2.183.33±2.4483.41±1.1183.13±2.3188.69±1.28蛋黄颜色9.67±0.36b8.5±0.81b9.71±0.29b8.40±0.75b8.60±0.31b9.10±0.38b11.13±0.39a蛋壳厚度/mm0.33±0.01abc0.31±0.02c0.33±0.01abc0.31±0.00c0.32±0.01bc0.35±0.01a0.34±0.01ab3讨论3.1日粮添加VD3对蛋黄中VD3含量的影响VD是一种脂溶性维生素，在动物生长发育中具有非常重要的作用，可调节钙磷代谢。目前的研究多集中于VD对动物生长性能、骨骼发育的影响。雏鸡缺乏VD可导致生长发育缓慢、骨骼畸形、变脆或者变软等现象；产蛋母鸡缺乏VD可导致产蛋量下降、蛋壳变薄、变软等问题的出现，严重影响产蛋性能[11]。VD能够增强鸡的先天免疫反应，缓解球虫对肉鸡的危害[22-23]。康乐等[24]在日粮中添加不同水平的VD3，结果显示，与未添加VD3组相比，添加组能够显著提高产蛋率，改善蛋壳品质，降低料蛋比。Sabbah等[25]发现，提高日粮添加VD3能够增加产蛋量，VD3提升至5 000 IU~6 950 IU/kg时，可延长蛋鸡的产蛋周期。Yao等[26]发现，将室内笼养蛋鸡日粮中的VD3水平提高至24 700 IU/kg时，可将蛋黄中VD3水平提高至24 110 IU/kg，低于本试验27 600 IU/kg VD3日粮所达的53 523 IU/kg。原因在于室外饲养模式下的蛋黄VD3含量显著高于室内养殖模式下蛋黄VD3含量[27]。不同品种、不同季节、不同环境均可导致蛋黄VD3含量不同。3.2日粮添加VD3对鸡蛋中钙、磷含量的影响VD能够治疗佝偻病，调节钙、磷代谢。Adhikari等[28]以不同水平的VD3日粮饲喂蛋鸡，采集粪便测定钙磷代谢率，结果发现，高水平的VD3能够提高蛋鸡对钙和磷的利用率。本试验结果显示，试验组蛋黄、蛋清和蛋壳中的钙含量与对照组相比差异均不显著。原因在于日粮中高水平的VD3提高了蛋鸡对钙的吸收，但未能够将钙富集于鸡蛋中，相反沉积至骨骼、内脏或随粪便排出。有研究表明，增加日粮中磷或VD3水平能够显著提高蛋鸡血浆磷含量[29-30]。本试验结果显示，高水平的VD3日粮能够显著提高蛋清磷含量，对蛋黄和蛋壳中磷含量无显著影响，说明提高日粮中VD3水平能够促进蛋鸡对磷的吸收，并能够将磷富集至蛋清。3.3日粮添加VD3对蛋品质的影响蛋重是评价蛋品质的一项重要指标，也是评价鸡蛋等级的基本依据。Wen等[31]以1 681、8 348、18 348、35 014、68 348 IU/kg的VD3日粮饲喂海兰W36雏鸡至68周龄，各组间蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重无显著差异。本试验结果显示，日粮添加VD3对蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重均无显著影响，与上述研究结果一致。Persia等[32]以不同水平的VD3日粮饲喂蛋鸡40周，发现24 700 IU/kg组的蛋重、蛋清重、蛋黄重和蛋壳重均为最高，蛋黄重和蛋壳重显著高于2 200 IU/kg组。因此，最佳添加VD3水平为24 700 IU/kg。本试验发现，设置的中间浓度组试验6组（VD3水平为51 600 IU/kg）的蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重均高于其他组。蛋黄颜色主要取决于家禽从外界摄入的色素的种类和数量、蛋鸡的年龄和品种、生理状况、饲养方式、环境因素和日粮组成等[33-34]。Park等[33]研究表明，日粮中增加较低水平VD3对蛋黄颜色无影响，饲喂高水平VD3日粮（102 200 IU/kg）能够显著提高蛋黄颜色[32]。本试验中最高添加浓度的试验7组（VD3水平为99 600 IU/kg）的蛋黄颜色，在不同试验时间点均显著高于对照组。蛋壳颜色主要受蛋鸡的遗传背景、营养水平、环境因素和健康状况的影响[35]。本试验中，第10 d和第20 d，试验7组的蛋壳颜色与对照组相比无显著差异；但第30 d时，试验7组的蛋壳颜色显著浅于对照组。原因在于芦花鸡作为地方品种，蛋壳颜色本身存在浅褐色和灰白色，对蛋壳颜色的测定存在一定影响[36]。有研究指出，蛋壳颜色主要由附着于蛋壳的最外层色素决定；在蛋壳颜色形成前，蛋黄和蛋清早已形成。因此，有学者认为，蛋壳颜色不会影响鸡蛋的营养价值[37]。4结论提高芦花蛋鸡日粮中的VD3水平可显著增加其在蛋黄中的富集，对蛋黄、蛋清和蛋壳中钙含量以及蛋黄、蛋壳中磷含量无显著影响。日粮中VD3提高至27 600~99 600 IU/kg时，可显著提高磷于蛋清中的富集；日粮中高水平VD3可显著提高蛋黄颜色，对其他蛋品质指标无负面影响。