木质纤维素是丰富的可再生资源[1-2]，主要包含纤维素、半纤维素和木质素[2]。纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键结合起来的链状高分子化合物[3]。木聚糖是半纤维素的主要成分，常在纤维素与木质素连接的交界处，对纤维包合力和细胞壁结构的完整性有重要作用[4]。微生物降解木质纤维素具有反应条件温和、污染较小的特点，是目前研究最广泛的利用方式[5-6]。秸秆是木质纤维素资源的主要来源之一。我国每年粮食作物产生的秸秆总量超过7亿t[7]。秸秆难以被动物分解利用，主要进行还田处理[8]。受低温影响，我国北方地区秸秆降解速度缓慢[9-10]。现有研究中较多的是对中高温纤维素降解菌群的研究，对低温纤维素酶菌株的研究较少[11]。青藏高原独特的自然地理环境赋予其丰富的降解纤维素类物质的微生物物种和基因资源[12-13]。在高寒草地生态系统中，木质纤维素分解功能菌群在碳素循环的过程中占重要位置，其数量占相对优势[14]。文章从青藏高原高寒草甸土壤中筛选产低温纤维素酶和木聚糖酶菌株，对其酶学性质进行初步探究，以期筛选出耐低温木质纤维素降解菌株，为北方地区秸秆还田快速降解提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源青海省门源县（3 175 m，37 °N101 °E）高寒草甸土壤，采用梅花采样法获取样品，过筛，-20 ℃冷冻保存。1.1.2主要培养基产纤维素酶筛选性培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5.0、NaNO3 3.0、K2HPO4 1.31、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、琼脂粉20.0，pH值5.5~6.0，121 °C灭菌20 min。产木聚糖酶筛选性培养基（g/L）：木聚糖5.0、NaNO3 3.0、K2HPO4 1.31、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、琼脂粉20.0，pH值5.5~6.0，121 °C灭菌20 min。纯化圈培养基（g/L）：马铃薯200.0、葡萄糖20.0，pH值5.5~6.0，121 °C灭菌20 min。产纤维素酶培养基（g/L）：CMC-Na 5.0、蛋白胨3.0、NaNO3 3.0、K2HPO4 1.31、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01，pH值5.5~6.0，121 °C灭菌20 min。产木聚糖酶培养基（g/L）：木聚糖 5.0、蛋白胨3.0、NaNO3 3.0、K2HPO4 1.31、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01，pH值5.5~6.0，121 °C灭菌20 min。1.1.3试剂与仪器DNS试剂配置方法参考文献[15]；CMC-Na购自国药集团化学试剂有限公司；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海生工有限公司；木聚糖为自提玉米芯木聚糖，提取方法参考文献[16]；刚果红购自天津市风船化学试剂有限公司；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司；琼脂粉购自天津市大茂化学试剂厂。酶标仪（Bio-Rad laboratories Inc）、生物显微镜（OLYMPUS有限公司）、气浴恒温振荡器、高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、恒温水浴锅（上海科銮仪器有限公司）、高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2试验方法1.2.1产低温纤维素酶和木聚糖酶菌株筛选初筛：用无菌水稀释样品至10-3倍，取200 μL均匀涂布于筛选培养基，20 ℃培养72 h。选取单菌落接种于纯化培养基，纯化后的菌株点种于筛选培养基，20 ℃培养72 h。采用刚果红染色法，选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株为初筛菌株。复筛：初筛菌株分别于产纤维素酶培养基和产木聚糖酶培养基（20 ℃、200 r/min）培养72 h，取培养液12 000 r/min离心10 min，制备粗酶液。取粗酶液测定纤维素酶和木聚糖酶活力，酶活力最高菌株为目的菌株。1.2.2酶活力的测定采用DNS法测定菌株产纤维素酶活力和木聚糖酶活力。纤维素酶活力测定：250 μL粗酶液与250 μL底物（1% CMC-Na溶液）混匀，40 ℃反应30 min，加入750 μL DNS终止反应，沸水浴10 min显色，冷却至室温后于540 nm波长测定吸光度，对照组粗酶液沸水浴5 min灭活。酶活定义：在40 ℃、pH值6条件下，1 min水解1% CMC-Na溶液产生1 μg还原糖的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。木聚糖酶活力测定：300 μL粗酶液与450 μL底物（1%木聚糖溶液）混匀，40 ℃水浴反应30 min，加入750 μL DNS终止反应，沸水浴10 min显色，冷却至室温，于540 nm波长测定吸光度，对照组粗酶液沸水浴5 min灭活。酶活定义：40 ℃，pH值6条件下，1 min水解1%木聚糖溶液产生1 μg木糖的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。1.2.3菌株鉴定方法形态学鉴定：采用筛选培养基20 ℃培养72 h，观察菌落形态特征。分子生物学鉴定：采用真菌基因组快速抽提试剂盒提取菌株基因组。采用通用引物ITS1和ITS4扩增目的菌株ITS区的基因序列，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，送至上海生工有限公司测序，并在NCBI进行序列比对。1.2.4酶学性质初步研究最适温度：在20、30、40、50、60、70 ℃条件下测定粗酶液纤维素酶和木聚糖酶活力。温度稳定性：粗酶液在20、30、40、50、60、70 ℃保温30 min，40 ℃测定纤维素酶和木聚糖酶的剩余酶活力。最适pH值：粗酶液分别与pH值为4、5、6、7、8、9的底物反应，40 ℃测定纤维素酶和木聚糖酶活力。pH值稳定性：粗酶液与pH值为4、5、6、7、8、9的缓冲液1∶1混匀，保温1 h，40 ℃测定纤维素酶和木聚糖酶的剩余酶活力。金属离子：分别加入10 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+于反应体系中，不添加金属离子为对照组，40 ℃测定目标菌株纤维素酶活力。1.2.5菌株产酶曲线测定目标菌株接种于产酶培养基，20 ℃、200 r/min培养，间隔6 h取样1次，测定纤维素酶和木聚糖酶活力，绘制菌株产酶曲线。1.3数据统计与分析数据使用SPSS 20.0进行差异显著性分析。2结果与分析2.1菌株FY8的水解圈（见图1）由图1可知，从青藏高原高寒草甸土壤样品中筛选一株同步产低温纤维素酶和低温木聚糖酶的菌株FY8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F001图1菌株FY8水解圈2.2菌株FY8的形态特征（见图2）由图2可知，菌株FY8菌落较厚，呈深绿色厚绒毛状，近圆形，不易挑起，菌落背面黑色。该菌株的菌丝呈匍匐蔓延生长，菌丝呈黄褐色、有隔膜、排列紧密、有卵圆形分生孢子。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F002图2菌株FY8形态特征菌株FY8系统发育树见图3。由图3可知，该菌的ITS基因序列与已知菌株Cladosporium sp. CMRP2498的ITS基因序列（登录号MF154612.1）相似度99%，确定菌株FY8为枝孢霉菌（Cladosporium sp.）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F003图3菌株FY8系统发育树2.3酶学性质初步研究2.3.1温度对酶活的影响（见图4）由图4可知，20~70 ℃时，两种酶活力均随温度升高先增后降，在40 ℃时酶活力为最大值。因此，菌株FY8产生的纤维素酶和木聚糖酶均属于低温酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F004图4温度对酶活的影响2.3.2pH值对酶活的影响（见图5）由图5可知，该菌产纤维素酶反应的最适pH值为7，产木聚糖酶反应的最适pH值为5，木聚糖酶在pH值5~7时相对酶活在90%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F005图5pH值对酶活的影响2.3.3温度对酶活稳定性的影响（见图6）由图6可知，40 ℃、恒温30 min，纤维素酶和木聚糖酶剩余相对酶活均为最大值。纤维素酶在20~60 ℃，恒温30 min，相对酶活在75%以上；木聚糖酶在20~50 ℃，恒温30 min，相对酶活在75%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F006图6温度对酶活稳定性的影响2.3.4pH值对酶活稳定性的影响（见图7）由图7可知，菌株FY8产纤维素酶在pH值4~8处理1 h，能保持87%以上的相对酶活。木聚糖酶在pH值4~6处理1 h，能保持85%以上的相对酶活。因此，这两种酶在酸性和中性环境下均有良好的耐受性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F007图7pH值对酶活稳定性的影响2.3.5金属离子对酶活的影响（见图8）以不添加金属离子的纤维素酶活力为100%。由图8可知，Mn2+、Fe2+、Cu2+对纤维素酶和木聚糖酶均有明显的促进作用，其中Mn2+对纤维素酶的促进作用最大，相对酶活为206%，Fe2+对木聚糖酶的促进作用最大，相对酶活为179%。Na+、K+对纤维素酶和木聚糖酶均有抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F008图8金属离子对酶活的影响2.3.6菌株FY8的产酶曲线（见图9）由图9可知，菌株FY8产纤维素酶和木聚糖酶随培养时间增加酶活力先逐渐增大后缓慢下降。在78 h时木聚糖酶活力达到最大值0.26 U/mL，在84 h时纤维素酶活力达到最大值0.28 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.017.F009图9菌株FY8的产酶曲线3讨论枝孢菌属是常见真菌微生物，属于半知菌类，能够产生串状分生孢子。目前发现的枝孢菌多寄生于植物或者为腐生菌中，具有降解木质纤维素的能力[17]。枝孢霉菌具有产纤维素酶的能力。马锐[18]从新疆、青海、云南高原土壤中分离出17株枝孢霉菌（Cladosporium），确定6个枝孢霉菌新种，首次揭示土壤是枝孢霉菌的重要生态位。衡文等[19]和文晓霞等[20]分别对枝孢菌AY-42产纤维素酶液态发酵条件和固态发酵条件进行优化，酶活相比优化前分别提高30.03%和57.72%。李季蓉等[21]从大连湖湿地公园土壤中分离获得４株真菌，经形态学分别鉴定为枝孢霉属、镰孢属、漆斑霉属和青霉属，其中枝孢霉属的纤维素降解酶活力最高为2.09 IU/mL。张爽[22]从土壤样品中通过低温驯化培养筛选出3株高效低温纤维素酶降解菌，其中菌株ZS-7为枝孢霉菌。王飞等[23]从南极罗斯海沉积物样品中分离出54株真菌，枝孢属为优势菌株，大多数真菌能检测到胞外水解酶活性。4结论本研究从青藏高原高寒草甸土壤中筛选一株同时产低温纤维素酶和低温木聚糖酶的菌株FY8。通过形态学和分子生物学鉴定，该菌株为枝孢霉菌（Cladosporium sp.）。枝孢霉菌FY8能够同时产生低温纤维素酶和低温木聚糖酶。纤维素酶最适反应温度40 ℃，最适pH值7.0；20~50 ℃、pH值4.0~9.0条件下相对酶活力保持在75%以上；金属离子中Mn2+对纤维素酶活力具有明显激活作用。该菌所产木聚糖酶最适反应温度40 ℃，最适pH值5.0；20~50 ℃、pH值4.0~7.0条件下相对酶活力保持在75%以上；金属离子中Fe2+对木聚糖酶活力具有明显激活作用。该菌株在培养78 h后，木聚糖酶活力达到最高值，培养84 h后纤维素酶活力达到最高值。后续将深入开展菌株发酵条件优化和酶的分离纯化工作，研究菌株FY8的粗酶活力，以获得性能优良的木质纤维素降解菌株与酶资源。