我国水产养殖细菌性病害达半数以上[1]，包括爱德华氏菌（Edwardsiella）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、河流弧菌（Vibrio fluvialis），可引发鱼类、虾蟹类和贝类患细菌性疾病，引起败血症、腐皮病和脓疱病等症状，对养殖产业经济造成严重损失[2-3]。如爱德华氏菌宿主主要为鲇形目鱼类[4]；河流弧菌常见于海水养殖动物，具有较强的致病性，病死率高[2]；溶藻弧菌是凡纳滨对虾、点带石斑鱼、鲑点石斑鱼、杂色鲍等养殖品种暴发性疾病主要致病菌之一[5]；副溶血弧菌是造成对虾早期死亡综合征、对虾急性肝胰腺坏死综合征的病原体，常见于海水鱼、虾、蟹、贝等水产品种。人类误食副溶血弧菌污染的水产品事件逐年呈上升趋势[6]。目前，生产中普遍采用投放抗生素控制病害，渔药滥用现象非常普遍，易造成病原菌耐药性，不断加大用药量，扩大化学药物种类，导致水体污染，药物残留严重威胁人类身体健康。因此，寻找适合环境友好的新型药物替代抗生素符合绿色发展的要求，植物源渔药是理想的选择之一。芒果属漆树科，芒果叶对耐药志贺痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌[7-8]等细菌，链格孢属真菌[9-10]、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、芒果炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌以及西瓜枯萎病菌等[11]真菌均具有显著的抑菌效果。芒果叶所含大量黄酮，具有抑菌消炎作用[12]，包括芒果苷、高芒果苷、异芒果苷、槲皮素等多种化学成分[13-14]。文章采用乙醇提取芒果叶中次生代谢物，以常见的10种鱼类病原菌为靶标菌，采用牛津杯法测试粗提物对靶标菌的活性，探讨最低有效浓度对靶标菌活性差异，为生物抑菌剂的开发及应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料供试植物芒果叶片采集自福建省厦门市集美大学校园，采集部位包含茎、叶。共有10种供试细菌进行测试，菌种来自集美大学水产学院渔药研发中心实验室保存样品。菌种类型包括河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、爱德华氏菌、无乳链球菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、绿脓杆菌。1.2试剂与仪器主要试剂：无水乙醇（99.97%）和2%生理盐水购自西陇科学股份有限公司；LB肉汤、LB营养琼脂、营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）、脑心浸液琼脂（BH）、脑心浸出液肉汤（BHI），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。主要仪器：R-215旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）、LRH-250生化培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）、800Y高速多功能摇摆粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）。1.3植物样品提取与浓度配置洗净样品，60 ℃恒温烘干24 h，粉碎，称重。将粉末与无水乙醇按照1∶10浸泡于锥形瓶密封，150 r/min 20 ℃恒温摇床72 h。纱布过滤植物粉末，滤液蒸发获得粗提物，称重。50%乙醇将粗提物配制为0.05、0.10、0.20、0.40 g/mL的溶液。1.4供试菌悬液的制备将4 ℃保存的供试菌种分别划线接种于固体培养基（弧菌接种于NB固体培养基，无乳链球菌接种于脑心浸出液固体培养基，其余供试菌接种于LB固体培养基）,35~37 ℃培养24 h；挑取单个菌落再次接种于相应固体培养基，培养24 h；挑取单菌落接种于相应的肉汤于恒温摇床（37 ℃、100 r/min）培养24 h。根据预试验取5 mL菌液离心得到菌沉淀，以灭菌的2%生理盐水1∶1稀释，取100 μL于酶标板测吸光光度值，直至吸光光度值约为0.25；此时浓度为108 CFU/mL，将菌悬液稀释至浓度为106 CFU/mL的菌悬液。1.5抑菌圈直径的测定取100 μL 106 CFU/mL菌液放入平板培养基均匀涂布。培养基底部分为5个区域，每个区域放入1个牛津杯（内径5 mm，高10 mm），轻轻按压与培养基紧密接触。分别吸取100 μL植物提取液放入牛津杯，每个浓度（0.05、0.10、0.20、0.40 g/mL）重复3次，50%乙醇为对照。平板培养基放入4 ℃冰箱3 h（植物提取液渗透至培养基），37 ℃培养24 h观察结果，若有抑菌圈形成即表明有抑菌活性。按十字交叉法测量抑菌圈直径，参考《抗微生物药物敏感性试验执行标准》判断对药物的敏感性，抑菌圈试验的判定标准为：极敏感时抑菌圈直径20 mm，高度敏感时抑菌圈直径为15~20 mm，中度敏感时抑菌圈直径为10~15 mm，低度敏感时抑菌圈直径为5~10 mm，无抑制作用（≤5 mm）为不敏感[15]。1.6抑菌率的测定平板培养基划分为3个区，每区放置4个牛津杯，每个牛津杯中加入100 μL植物提取液，室温放置3 h，去掉牛津杯待植物提取液完全渗透。对照组为50%乙醇，每种植物设置浓度梯度，分别为0.05、0.10、0.20、0.40 g/mL。采用灭菌小钢管（直径5 mm）打菌饼，将含有菌丝的菌饼朝下覆盖于培养基上，每个区域一块，每皿3块，每个处理3个培养皿。培养皿37 ℃培养24 h，采用十字交叉法测量菌饼的直径并计算抑菌率[16]。菌饼直径＝测量菌饼直径平均值-5.0(1)抑菌率=100×(对照菌饼生长直径－处理菌饼生长直径)/对照菌饼生长直径(2)1.7最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定采用试管2倍稀释法测定最小抑菌浓度[17]：取10支灭菌的2 mL试管，2~9管分别加入对应的液体培养基0.50 mL（弧菌对应加NB液体培养基，无乳链球菌对应加脑心浸出液液体培养基，其余菌对应加LB液体培养基）。第1、2管中加入灭菌的0.50 mL 1 g/mL植物提取液，第2管混匀后吸取0.50 mL加入第3管，依次类推至第8管；第8管吸取0.50 mL弃去，使各管呈1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等浓度梯度。向1~8管中分别加入0.50 mL菌液，第9管不加植物提取液，加菌液0.50 mL作为对照，观察细菌的生长情况。第10管加植物提取液0.50 mL，混匀不加菌液，观察提取液是否被污染。重复试验3次，各管37 ℃恒温培养24 h，观察结果。若药液透明，可直接判定该浓度为MIC；若色泽较深，则挑取1环培养液于相应固体培养基划线培养24 h，观察结果，以无菌生长的最低稀释度为MIC。取50 μL细菌培养物涂布于LB固定培养基，培养箱24 h，以无菌落生长的培养液最小浓度为MBC。试验重复3次。1.8数据统计与分析数据采用Excel软件进行统计，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1芒果叶提取液抑菌活性筛选（见表1）由表1可知，芒果叶提取液对7种病原菌(河流弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、爱德华氏菌以及无乳链球菌)均有抑菌圈出现，即具有抑菌活性；对创伤弧菌、嗜水气单胞菌和绿脓杆菌均无抑菌效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.013.T001表1芒果叶提取液对病原菌的抑菌活性项目结果河流弧菌+溶藻弧菌+创伤弧菌-副溶血弧菌+嗜水气单胞菌-金黄色葡萄球菌+大肠杆菌+绿脓杆菌-爱德华氏菌+无乳链球菌+注：“-”表示无抑菌活性，“+”表示具有抑菌活性；下表同。2.2芒果叶提取液对7种病原菌抑菌圈直径的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，各处理组抑菌圈直径均显著提高（P0.05），随提取液浓度的增加而增大。0.40 g/mL浓度的提取液对爱德华氏菌的抑制效果最好，抑菌圈直径为20.02 mm，属极度敏感，显著高于其他处理组。对河流弧菌抑制效果次之，低浓度0.05 g/mL至高浓度0.40 g/mL抑菌圈范围为15~19 mm，属高度敏感；对无乳链球菌效果最差，抑菌圈直径约为8~15 mm，属低中度敏感。对副溶血弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌抑制作用表现为中度敏感，抑菌圈范围为10.00~15.00 mm；对大肠杆菌抑菌活性为中高度敏感，抑菌圈范围为10.33~17.67 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.013.T002表2芒果叶提取液对7种病原菌抑菌圈直径的影响项目芒果叶提取液浓度/(g/mL)对照（50%乙醇）0.050.100.200.40河流弧菌15.00±0.00Ac17.33±0.47Ab18.00±0.82Aab19.00±0.00Ba0.00±0.00d副溶血弧菌10.00±0.00Dc13.33±0.47Cb14.33±0.47Ca15.00±0.00Da0.00±0.00d溶藻弧菌10.67±0.47CDc13.33±0.47Cb14.00±0.00Cb15.00±0.00Da0.00±0.00d金黄色葡萄球菌11.33±0.47Cc12.67±0.47CDb13.67±0.47Cab14.33±0.47Da0.00±0.00d大肠杆菌10.33±0.47Dd12.00±0.00DEc15.67±0.47Bb17.67±0.47Ca0.00±0.00e爱德华氏菌13.00±0.00Bd15.33±0.47Bc17.00±0.82Ab20.02±0.04Aa0.00±0.00e无乳链球菌8.00±0.00Fd11.00±0.00Ec14.00±0.00Cb15.00±0.00Da0.00±0.00e注：同行数据肩标不同小写字母表示不同浓度对同一病原物抑菌圈平均直径间差异显著（P0.05），同列数据肩标不同大写字母表示同一浓度对不同细菌病原物抑菌圈平均直径间差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mm2.3芒果叶提取液对供试细菌MIC和MBC的影响（见表3、表4）由表3可知，芒果叶提取液对河流弧菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、爱德华氏菌的MIC为25.00 g/L；对副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的MIC为50.00 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.013.T003表3芒果叶提取液对供试细菌MIC的影响项目芒果叶提取液浓度/(g/L)100.0050.0025.0012.506.253.131.560.78河流弧菌---+++++无乳链球菌---+++++副溶血弧菌--++++++溶藻弧菌--++++++金黄色葡萄球菌---+++++大肠杆菌--++++++爱德华氏菌---+++++由表4可知，芒果叶提取液对溶藻弧菌的MBC为50.00 g/mL；对河流弧菌、无乳链球菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MBC为25.00 g/L；对爱德华氏菌的MBC为6.25 g/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.013.T004表4芒果叶提取液对供试细菌MBC的影响项目芒果叶提取液浓度/(g/L)100.0050.0025.0012.506.253.131.560.78河流弧菌---+++++无乳链球菌---+++++副溶血弧菌---+++++溶藻弧菌--++++++金黄色葡萄球菌---+++++大肠杆菌---+++++爱德华氏菌-----+++2.4芒果叶提取液对供试细菌抑菌率的影响（见表5）由表5可知，随着浓度增加，提取液对个致病菌的抑菌率显著提高；其中浓度0.40 g/mL对爱德华氏菌的抑制率最高，为91.67%；对金黄色葡萄球菌、河流弧菌、大肠杆菌抑菌率均超过81.25%。各浓度提取液对无乳链球菌的抑菌率最低，为14.81%~46.30%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.013.T005表5芒果叶提取液对供试细菌抑菌率的影响项目芒果叶提取液浓度/(g/mL)0.050.100.200.40河流弧菌27.44±0.00Cd42.31±0.00Dc61.28±0.00Db84.62±0.00Ca无乳链球菌14.81±0.00Ed22.35±0.00Gc35.06±0.00Gb46.30±0.00Ga副溶血弧菌19.38±0.01Dd28.54±0.01Fc46.67±0.00Eb59.38±0.00Ea溶藻弧菌20.67±0.00Dd32.44±0.01Ec46.44±0.00Eb56.44±0.00Fa金黄色葡萄球菌38.00±0.03Ad60.00±0.00Ac80.00±0.00Ab88.00±0.03Ba大肠杆菌34.38±0.00Bd46.88±0.00Cc62.71±0.00Cb81.25±0.00Da爱德华氏菌37.36±0.00Ad49.86±0.00Bc79.17±0.00Bb91.67±0.00Aa%3讨论芒果叶具有提高生物免疫力的效果，作为饲料添加剂具有成熟的技术[18-19]和广阔的应用前景。饲料中添加芒果叶浸膏可明显提高罗非鱼、鲤鱼和甲鱼的生长速度，提高抗氧化能力和免疫力。8‰的芒果叶浸膏饲料可将罗非鱼幼苗的成活率提高6.48%，显著降低鲤鱼血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低甲鱼血清中的脂质过氧化物丙二醛MDA的含量[20]。饲料中添加肌酸和芒果提取物能够改善猪肉的品质，提高猪肉瘦肉率，促进猪生长，提高猪免疫力[19]。芒果甙可通过降低脂质过氧化改善肉质，在玉米-豆粕型日粮中添加300 g/kg芒果叶提取物可以提高肉鸡的生长性能，改善胸肌肉品质，促进血液、脂肪代谢[21]。1％的芒果叶黄酮浸膏可提高观赏鱼的免疫力，促进生长[22]。此外，芒果叶还可作为治疗锦鲤病毒性疾病的饲料添加剂[23]。利用芒果叶提取物作为添加剂可提高动物机体免疫力，改善肉质等，还具有取材方便、经济环保等优势。本试验结果表明，芒果叶提取物对河流弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、爱德华氏菌、无乳链球菌均具有抑菌作用。谢三都等[24]报道，芒果叶黄酮类化合物对李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均具有抑制作用。芒果叶中的黄酮类化学物可对细菌产生抑制效果，其中芒果苷受到广泛的关注。芒果苷的各种药理作用，包括抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等，但芒果苷的溶解性和跨膜通透性低，制约药效的发挥。因此，很多科学家研究不同的分离提取芒果苷的方法，提高芒果苷的生物利用率，包括酯提除杂法、超声提取法、微波辅助提取以及闪式提取法等。黄春萍等[25]提取的芒果苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度均为1.25 g/L。芒果果皮分离的芒果苷、儿茶素和芦丁对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较强的抑菌活性[26]。本试验采用芒果叶粗提物，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为50.00、25.00 g/L，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌率均超过81.25%；但芒果苷的提取率或者有效浓度有待进一步验证。此外，植物提取液中的可溶性糖、酚类物质也具有抑菌性能，需要进一步分离纯化测试。植物源杀菌、杀虫剂多集中在植物保护研究中，比较成熟的杀虫剂产品包括苦参碱、苦皮藤素、印楝素、鱼藤酮以及烟碱等；杀菌剂包括大蒜素、香芹酚、蛇床子素、氨基寡糖素等。植物产品和水产品不同，在开发植物源杀菌剂也应考虑鱼的急性中毒剂量。部分植物源鱼类杀菌剂多集中于中草药的研究，如60 g/L由黄柏、黄连组成的复方对河流弧菌抑菌作用极敏感[2]；而有些中草药表现为提高鱼类免疫力，如通过添加五倍子、白头翁、地榆、柯子、虎杖显著增强白细胞氧呼吸爆发[27]。本试验结果表明，芒果叶提取物对7种常见鱼类病原菌均具有显著抑制作用，其中爱德华氏菌的抑制率最高，为91.67%；利用芒果叶提取物抑制爱德华氏菌试验尚未报道，许多鱼类受到该细菌感染大量死亡。本试验采用体外细菌试验，对体内感染试验还需进一步验证。抗生素被广泛应用以来，细菌耐药性愈演愈烈，耐药机制复杂，甚至产生广谱性耐药机制。如何减少耐药菌的产生，合理使用抗生素类药物促进水产养殖业的健康发展，植物源抑菌剂为减少或者替代抗生素的应用提供更多的选择。4结论本试验中，芒果叶提取物对水产常见细菌性病原物河流弧菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、爱德华氏菌和大肠杆菌均表现强烈的抑菌作用，其中对爱德华氏菌的抑制率最高，为91.67%；对金黄色葡萄球菌、河流弧菌、大肠杆菌抑菌率均超过81.25%。后续研究中，可将提取物进一步分离纯化，结合生物活性测定，筛选得到活性物质，为植物源抑菌剂的开发提供依据。