蛋氨酸（methionine），又名甲硫氨酸，是牛所需的第一或第二限制性氨基酸，参与机体内各种甲基化反应，磷代谢、肾上腺素、胆碱和肌酸的合成等，蛋氨酸对动物的生长发育起重要作用[1]。缺乏蛋氨酸会降低饲料功效，抑制动物生长[2]。在氨基酸生产中，发酵法已在苏氨酸、组氨酸、赖氨酸和异亮氨酸等生产中成功应用。因此，采取营养缺陷型进行诱变育种，筛选高产蛋氨酸菌株，是解决饲料蛋氨酸营养供应的有效途径和发展方向。成年牛瘤胃栖息着数目巨大的微生物，瘤胃微生物可以分解纤维素、半纤维素及木质素等，为牛的生长发育提供所需营养[3-4]。研究发现，反刍动物瘤胃微生物所合成的菌体氨基酸（其中含有丰富的蛋氨酸）可直接到达小肠，并被小肠吸收[5]。因此，本试验以牛瘤胃液为样本，通过蛋氨酸缺陷培养基对微生物进行厌氧培养，筛选出可自身合成并向环境中释放游离蛋氨酸的微生物菌株，为研制适用于反刍动物的蛋氨酸微生物添加剂提供前期试验基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品采集及保存牛瘤胃液采自内蒙古赤峰市克什克腾旗草原放牧饲养的草原红牛。通过胃管抽取瘤胃液，将瘤胃液装入通入CO2气体的烧瓶中，密封。瘤胃液在实验室超净台中经4层纱布过滤，-80 ℃冷冻，保存。1.1.2培养基、人工唾液及发酵日粮蛋氨酸缺陷混合物溶液：将蛋氨酸缺陷混合物粉末（青岛海博生物技术有限公司）0.51 g加入10 mL去离子水中，混匀，过滤除菌，冷藏。蛋氨酸缺陷混合物成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T001表1蛋氨酸缺陷混合物成分成分含量成分含量赖氨酸2.0对氨基苯甲酸0.2半胱氨酸2.0亮氨酸10.0腺嘌呤0.5苯丙氨酸2.0丙氨酸2.0脯氨酸2.0精氨酸2.0谷氨酰胺2.0天冬酰胺2.0丝氨酸2.0天冬氨酸2.0苏氨酸2.0谷氨酸2.0色氨酸2.0甘氨酸2.0酪氨酸2.0组氨酸2.0尿嘧啶2.0肌醇2.0缬氨酸2.0异亮氨酸2.0g/L蛋氨酸缺陷培养基：葡萄糖4.0 g、无氨基酸酵母氮源1.5 g、琼脂3.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO4 1.0 g、VB1 110.0 mg置于200 mL去离子水中，调节pH值至6.5，高压灭菌。蛋氨酸缺陷固体培养基：将上述液体温度降至50~60 ℃时加入蛋氨酸缺陷混合物溶液800 μL，倒入培养皿制成平板培养基，4 ℃冷藏。蛋氨酸缺陷液体培养基：将上述液体按10 mL分装至试管，冷却，使用前每只试管添加蛋氨酸缺陷混合物溶液40 μL。人工唾液：NaCO3 9.8 g、Na2PO3 9.3 g、KCl 0.57 g、CaCl2 0.04 g、NaCl 0.47 g、MgCl2 0.12 g定容于1 L去离子水中，通入CO2气体，使pH值降至6.5~7.0。人工唾液现用现制。体外模拟瘤胃发酵日粮：称取烘干后粉碎的精料45.38 g、羊草12.36 g、玉米秸秆青贮2.26 g、MgSO4 0.6 g，混匀制成模拟试验日粮。体外模拟瘤胃发酵日粮组成及原料营养水平见表2。日粮的代谢能为11.487 MJ/kg、粗蛋白为15.1%、干物质为80.7%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T002表2体外模拟瘤胃发酵日粮组成及营养水平（干物质基础）项目含量/%Neg/(MJ/kg)CP/%Ca/%P/%Na/%Cl/%干物质（DM）/%精料7015.73018.01.0500.6000.550.5585.0羊草201.0907.00.4000.1500.000.0691.0青贮102.58011.00.7000.2400.000.0030.01.1.3主要试剂及仪器主要试剂：无氨基酸酵母氮源、维生素B1、细菌基因组DNA提取试剂盒、可溶性淀粉、纤维素、尿素（北京索莱宝科技有限公司）；琼脂、氯化钠、硫酸镁、葡萄糖、蔗糖、硫酸铜、磷酸二氢钾（天津市化学试剂三厂）；16S rRNA通用引物（宝生物工程（大连）有限公司）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（爱思进生物技术）。主要仪器：超净工作台（苏州净化设备有限公司）、电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、5 L台式发酵罐（上海世远生物有限公司）。1.2试验方法1.2.1产蛋氨酸牛瘤胃微生物的分离鉴定1.2.1.1牛瘤胃微生物的分离纯化瘤胃内容物1 g与9 mL无菌水混合后静置，取上层悬液1 mL添加至装有9 mL无菌水试管中混匀，依此法分别制得梯度稀释倍数为10-2、10-3和10-4的瘤胃内容物悬液。取各稀释倍数瘤胃内容物悬液200 μL涂布于蛋氨酸缺陷固体培养基上，39 ℃厌氧培养。挑取单菌落，进行革兰氏染色镜检和三区划线分离纯化培养。1.2.1.2游离蛋氨酸合成量的检测将分离菌株接种到蛋氨酸缺陷液体培养基中，39 ℃厌氧培养48~72 h；以培养基为空白对照，委托青岛科标检测研究院有限公司对样品中游离蛋氨酸含量进行检测，选留含量最高菌株进行后续试验。1.2.1.316S rDNA V3~V4区PCR扩增及测序提取高产蛋氨酸菌株总DNA，使用通用引物（F：5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'；R：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）进行PCR扩增。扩增体系（30 μL）：16S rDNA模板3.0 μL、F：1.0 μL、R：1.0 μL、2×Taq Master Mix 15.0 μL、dd H2O 10.0 μL。扩增参数：94 ℃ 4 min，30×（94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min），72 ℃ 10 min。回收PCR产物并行测序。将测序结果与NCBI 16S数据库中数据比对，得到序列相似性最大物种。1.2.1.4菌株生化反应菌株生化特征依据《伯杰细菌鉴定手册》[6]鉴定。1.2.2菌株培养和发酵条件优化经上述鉴定，试验分离菌株为热带假丝酵母菌（Candida tropical TYM001）。1.2.2.1培养基成分的优化最适碳源：在不改变其余组分情况下，分别以蔗糖4.0 g、葡萄糖4.0 g、可溶性淀粉4.0 g、纤维素4.0 g作为碳源，39 ℃厌氧培养32 h，测定其OD600 nm值。最适氮源：在不改变其余组分情况下，分别以无氨基酸酵母氮源1.5 g、尿素1.5 g 、硫酸铵1.5 g、无氨基酸酵母1.5 g+尿素1.5 g作为氮源，39 ℃厌氧培养32 h，测定其OD600 nm值。最适无机盐：以最适碳源和氮源，在不改变其余组分情况下，分别以NaCl 1.0 g、NaCl 1.0 g+MgSO4 1.0 g、NaCl 1.0 g+CuSO4 1.0 g、NaCl 1.0 g+MgSO4 1.0 g+KH2PO4 1.0 g作为无机盐成分，39 ℃厌氧培养32 h，测定其OD600 nm值。培养基主要成分含量优化：以最适碳源、氮源和无机盐，将此3个因素各设置3个添加量水平，采用L9(34)正交试验设计，在不改变其余组分情况下，39 ℃厌氧培养32 h，测定其OD600 nm值。正交试验设计表见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T003表3供试菌游离蛋氨酸检测结果菌株编号游离蛋氨酸含量A2.133B1.179C1.373D2.050E4.386mg/L10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T004表4E菌株生化反应结果生化反应反应结果D-葡萄糖＋D-半乳糖＋D-山梨醇＋D-麦芽糖＋蔗糖＋D-乳糖－木糖醇－甘油－肌醇－注：“＋”为阳性反应；“－”为阴性反应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T005表5培养基优化L9（34）正交试验结果项目葡萄糖/(g/L)无氨基酸酵母氮源/(g/L)NaCl/(g/L)MgSO4/(g/L)KH2PO4/(g/L)OD600 nm值115.05.03.05.03.02.251±0.003215.010.04.06.04.02.384±0.001315.015.05.07.05.02.556±0.002420.05.04.06.04.02.374±0.004520.010.05.07.05.02.733±0.002620.015.03.05.03.02.365±0.002725.05.05.07.05.02.407±0.002825.010.03.05.03.02.236±0.004925.015.04.06.04.02.287±0.002K17.1917.0326.8526.8526.852K27.4717.3547.0457.0457.045K36.9307.2077.6957.6957.695k12.3972.4342.2842.2842.284k22.4902.4512.3482.3482.348k32.3102.4022.5652.5652.565R0.1810.1070.2810.2810.2811.2.2.2发酵条件优化在参考同类试验基础上进行预试验，确定发酵温度、装液量、发酵时间和接种量为影响游离蛋氨酸含量主要因素。发酵温度最高值按牛体温37~39 ℃确定[7]，最低温度是在预试验并参考文献[8]确定；按5 L容积发酵罐使用要求（装液量2~4 L）[9]，确定下限装液量2.5 L；考虑发酵过程中可能会产气等，上限装液量取3.5 L；发酵时间是在预试验达到一定活菌数为28 h并参考文献[10]确定的；接种量是在预试验最低接种量50 mL基础上确定的。按照L9(34)正交试验设计，发酵温度、装液量、发酵时间和接种量各设置3个水平。培养基按优化后的最适组分及其添加量制备，39 ℃厌氧培养32 h，对菌液中游离蛋氨酸含量进行检测。1.2.3体外模拟瘤胃发酵试验将4 g日粮、60 mL瘤胃液和150 mL人工唾液混合，调节pH值至6.5。试验组与对照组各设置3组重复，试验组添加热带假丝酵母菌TYM001 5×107 CFU，对照组不添加任何菌株；39 ℃厌氧培养，分别于0、6、18、24 h取样5 mL；测定样品中游离蛋氨酸和总蛋白含量（青岛科标检测研究院有限公司）及pH值。过滤发酵液，将滤渣45 ℃烘干至恒重，测其消化率。1.3数据统计与分析瘤胃体外模拟试验采用SPSS 23.0统计软件t检验方法分析。2结果与分析2.1菌株的分离纯化和鉴定2.1.1菌株纯化及革兰染色镜检结果（见图1、图2）由图1、图2可知，分离纯化的单菌落为灰白色、柔软光滑、边缘或有轻微皱褶。对单菌落进行革兰氏染色后呈阳性，菌体呈卵圆形。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.F001图1分离纯化得到的单菌落10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.F002图2革兰氏阳性球菌（1 000×）2.1.2游离蛋氨酸合成量检测结果（见表3）经分离纯化获得5株菌株，编号A~E。由表3可知，游离蛋氨酸含量最高为E菌株4.386 mg/L。因此，将E菌株作为目标菌株。2.1.3菌株16S rDNA测序结果E菌株16S rDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图3。由图3可知，PCR产物回收测序后长度为523 bp。16S rDNA测序结果与Candida tropicalis strain同源性比对结果见图4，E菌株与热带假丝酵母菌株（Candida tropicalis strain）相比仅缺失1个碱基，同源性为99.81%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.F003图3E菌株16S rDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果注：M为DNA Ladder Mix marker；1为E菌株；2为阴性对照。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.F004图416S rDNA测序结果与Candida tropicalis strain同源性比对结果2.1.4E菌株生化反应结果（见表4）由表4可知，E菌株对葡萄糖、半乳糖、山梨醇、麦芽糖和蔗糖为阳性反应，而乳糖、木糖醇、甘油和肌醇为阴性反应。2.1.5菌株定名结合上述各项检测结果，确定E菌株为热带假丝酵母菌，属隐球酵母目、隐球酵母科，菌株命名为热带假丝酵母TYM001（Candida tropical TYM001）。2.2菌株培养和发酵条件优化2.2.1培养基成分的优化热带假丝酵母TYM001培养基成分优化见图5。由图5可知，热带假丝酵母TYM001的最适碳源是葡萄糖，最适氮源是无氨基酸酵母，NaCl、MgSO4和KH2PO4均为最适的无机盐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.F005图5热带假丝酵母TYM001培养基成分优化2.2.2正交试验结果（见表5、表6）由表5可知，葡萄糖20.0 g/L、无氨基酸酵母10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO4 7.0 g/L和KH2PO4 5.0 g/L的K值最大；3种无机盐的R值相同，大于葡萄糖含量和无氨基酸酵母氮源含量。由表6可知，培养基中NaCl 5.0 g/L、MgSO4 7.0 g/L和KH2PO4 5.0 g/L均显著高于同成分其他处理（P0.05）。3种矿物盐含量的极差值均最大，方差分析中3种矿物盐最高时均有较大OD600 nm值，两者结果一致，因此确定试验组5的各成分剂量最佳。用试验组5培养基培养，OD600 nm值达到2.814，上述结论得到证实。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T006表6培养基优化方差分析结果项目平方和自由度均方F值显著性修正模型0.197a60.03324.2204.018×10-2截距51.806151.80638 296.3162.611×10-5葡萄糖0.04920.02418.1050.052无氨基酸酵母氮源0.01720.0096.3670.136NaCl0.0000MgSO40.0000KH2PO40.0000误差0.00320.001总计52.0069修正后总计0.1998注：1.R2=0.986（调整后R2=0.946）。2.F0.01=29.46，F0.05=9.28。2.2.3发酵条件优化热带假丝酵母TYM001发酵条件试验结果见表7、表8。由表7可知，各因子对发酵产物游离蛋氨酸含量影响主次关系为：发酵时间接种量发酵温度装液量。35 ℃、装液量3.5 L、发酵时间34 h、接种量180 mL的K值最大。由表8可知，比较发酵条件各处理，各因子不同处理间差异不显著（P0.05）。按极差分析结果，发酵时间的极差最大，而各发酵时间之间发酵产物游离蛋氨酸含量差异不显著，但趋势相同。根据上述分析结果，确定试验3是最佳条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T007表7热带假丝酵母TYM001发酵条件L9（34）正交试验结果项目发酵温度/℃装液量/L发酵时间/h接种量/mL游离蛋氨酸含量/(mg/L)1352.532607.2492353.03412022.7843353.53618027.8154372.53418027.8135373.0366011.4676373.53212011.8167392.53612018.0518393.0321807.1679393.5346013.702续表7　热带假丝酵母TYM001发酵条件L9（34）正交试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T009表8发酵条件正交试验主体间效应检验结果项目平方和自由度均方F值显著性修正模型512.220a864.0284.1810.362截距2 476.90812 476.908161.7560.050发酵温度59.712229.8561.9500.452装液量53.101226.5511.7340.473发酵时间258.7422129.3718.4490.236接种量155.110277.5555.0650.030误差15.313115.313总计3 180.06610修正后总计527.5339注：R2=1.000（调整后 R2 =-）；F0.01=28.71，F0.05=9.12。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T008项目发酵温度/℃装液量/L发酵时间/h接种量/mL游离蛋氨酸含量/(mg/L)K157.84853.11326.23232.418K251.09641.41864.29952.651K338.92053.33357.33362.795k119.28317.7048.74410.806k217.03213.80621.43317.550k312.97317.77819.11120.932R6.3093.97212.68910.1262.3体外模拟瘤胃发酵试验体外模拟瘤胃发酵试验结果见表9。通过t检验对比分析，试验组24 h瘤胃液中总蛋白、游离蛋氨酸含量均极显著高于空白对照组（P0.01）；24 h游离蛋氨酸含量差异达到28.893 mg/L，比对照组高62.67%。由于pH值和消化率是用3个发酵样本混合物测定的，无法进行差异显著分析，但可以看出试验组的消化率和pH值有增加趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.015.T010表9热带假丝酵母TYM001瘤胃体外模拟发酵试验结果项目0 h6 h18 h24 h试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验组对照组总蛋白/(g/100 g)0.470±0.0120.197±0.0060.490±0.0200.243±0.0060.440±0.0060.543±0.0060.480±0.0000.243±0.006P值3.86×10-63.36×10-62.92×10-53.96×10-7游离蛋氨酸含量/(mg/L)55.722±0.39645.301±0.36351.632±0.73036.078±2.16644.365±0.13737.729±3.07974.997±0.41946.104±1.000P值4.683×10-62.964×10-42.03×10-21.318×10-6pH值6.506.506.216.216.526.406.576.42消化率/%2.252.508.007.7521.2515.0025.5020.753讨论奶牛瘤胃液中分离的酵母菌作为饲料添加剂喂养高浓度日粮的奶牛，可以减少瘤胃乳酸产生[11]。从瘤胃中分离出来的酵母比从其他来源分离的酵母对反刍动物更有益[12]。热带假丝酵母菌，属隐球酵母目、隐球酵母科，是最常见的假丝酵母之一。研究发现，当机体免疫力下降时，热带假丝酵母菌作为条件性致病微生物引发局部或全身性感染及乳房炎[13]。但另一研究未发现热带假丝酵母菌能够引起奶牛患病[14]。杨春涛等[15]研究发现，将热带假丝酵母菌添加犊牛日粮中，断奶后犊牛的总能代谢率和氮利用率明显提高，粪能和总排除氮量显著降低，在一定程度上能够改善瘤胃发酵能力，未发生犊牛因添加热带假丝酵母菌而致病的情况。研究表明，热带假丝酵母能够促进瘤胃菌群，显著提高奶牛干物质表观消化率、牛奶总蛋白含量、总挥发性脂肪酸[16]，显著提高犊牛56日龄体重、犊牛宰前活重、胴体重、全胃重量、瘤胃重量等[17]。3.1热带假丝酵母菌TYM001培养和发酵条件的优化本试验培养基成分优化结果可知，热带假丝酵母菌TYM001对葡萄糖利用率最好，其次为蔗糖。由于蛋氨酸为含硫氨基酸，必然需要硫元素介入，所以无氨基酸酵母氮源与硫酸铵均有利于菌株成长。在无机盐组成试验中，只要有MgSO4存在，菌株均能够良好生长；但CuSO4对热带假丝酵母菌TYM001有毒害作用。经过发酵培养条件优化后，热带假丝酵母菌TYM001蛋氨酸合成量由起始的4.386 mg/L提高至27.815 mg/L，提高了534.30%。王铁良等[18]从奶牛瘤胃中筛选出1株高产蛋氨酸的甲基营养型芽孢杆菌，发酵条件优化后，蛋氨酸产量提高了175.86%。李文兵等[19]从新鲜牛粪中筛选出纤维素降解菌——内生芽孢杆菌（Bacillus endophticus），条件优化后，羧甲基纤维素酶活量提高了149.5%。3.2热带假丝酵母菌TYM001瘤胃模拟体外发酵瘤胃是一个厌氧生态系统，动物所消耗的营养素由一个系统发育和代谢多样的微生物群落发酵[20]。瘤胃pH值是发酵的重要指标。牛采食大量谷物或碳水化合物后，牛瘤胃pH值迅速降低。当pH值下降至5.0~5.6，牛会出现亚急性瘤胃酸中毒[21]。由于牛的特殊性，常用体外瘤胃方法模拟瘤胃的生理和代谢变化[22]。本试验发现，试验组和对照组的模拟瘤胃pH值均呈现先下降后上升趋势；在18 h和24 h，试验组pH值均高于对照组，与杨春涛等[15]结果一致。研究显示，人为添加的蛋氨酸在牛瘤胃中只能存在3 h便会被瘤胃微生物利用合成菌体蛋白。本研究中，菌株体外瘤胃发酵试验显示，试验组总蛋白和游离蛋氨酸含量极显著高于对照组。原因是添加的菌株强化了蛋氨酸合成，证明本试验分离的菌株能够很好地适应瘤胃环境。4结论以牛瘤胃液为样品分离得到一株产游离蛋氨酸菌株的热带假丝酵母菌TYM001（Candida tropical TYM001），可以分泌游离蛋氨酸27.815 mg/L。该菌株能够提高体外模拟瘤胃总蛋白和游离蛋氨酸含量。