目前，为保证畜禽养殖业正常发展，开发替代抗生素的新型、绿色、无公害饲料添加剂已成为趋势[1]。药食同源中药是天然的饲料添加剂，不易产生抗药性，是防治动物疾病、替代抗生素的理想选择[2]。益生菌微生态制剂可直接影响动物肠道微生物菌群结构，抑制有害菌生长，增强机体免疫力，缓解动物应激等[3]。利用益生菌发酵后的中药具有加强药效、改善风味、节约中药资源等优点，发酵液中含有大量活菌，保留了益生菌制剂的作用[4-6]。发酵中药具有广阔的应用前景[7-8]。菌酶协同发酵技术在微生物发酵过程中，加入高活性酶制剂，对提高原料营养价值、提高益生菌菌群活力、促进机体生长和消化、增强免疫力具有显著功效[9]。本试验依据菌酶协同发酵饲料的方法，发酵自选中药，优化发酵工艺，为新型饲料添加剂开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料植物乳杆菌（GDMCC 1.191）购自广东省微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌（FSCC 115036）购自广东环凯微生物科技有限公司。纤维素酶（3 000 U/g）、果胶酶（40 000 U/g）购自北京索莱宝科技有限公司。MRS培养基（培养植物乳杆菌用）、LB培养基（培养枯草芽孢杆菌用）均购自北京索莱宝科技有限公司。固体发酵培养基（底物）：黄芪、绞股蓝、马齿苋三味药（1∶1∶1）占75%、豆粕占15%、无水葡萄糖占10%。1.2试验方法1.2.1种子液的制备将实验室4 ℃保存的植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌菌液分别接种于新制备的MRS和LB液体培养基中，植物乳杆菌置于37 ℃恒温培养箱静态培养，枯草芽孢杆菌置于120 r/min摇床上37 ℃培养。24 h取出，进行平板菌落计数，活菌数≥1×108 CFU/mL，获得发酵用种子液，放入冰箱中冷藏。1.2.2发酵菌种的筛选将上述的种子液单独和按照不同比例按12%的总接菌量分别接种于灭菌后的固体发酵底物进行单菌发酵和双菌发酵试验，按料液比1∶1.4 g/mL，混合均匀，置于37 ℃恒温培养箱中静置发酵60 h，发酵结束后取样备用。1.2.3发酵酶的筛选将1.2.2中测得的最佳菌种比例按12%的总接菌量分别接种于灭菌后的固体发酵底物中，分组加入纤维素酶、果胶酶及两种酶不同比例组合，进行单酶发酵和双酶发酵，酶总添加量均为100 U/g，料液比1∶1.4 g/mL，混合均匀，置于37 ℃恒温培养箱中静置发酵60 h，发酵结束取样。将1.2.2中测得的最佳菌种比例按12%的总接菌量分别接种于灭菌后的固体发酵底物中，将上述中所测得的最佳酶比例按0、25、50、75、100、150、200、300 U/g总添加量接种于发酵底物，料液比1∶1.4 g/mL，混匀，置于37 ℃恒温培养箱中静置发酵60 h，发酵结束后取样。1.2.4正交试验优化最佳发酵条件以上单因素试验最优结果下设计正交试验，本试验筛选的发酵条件为：料液比（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、接菌量（D）。L9(34)正交试验设计见表1。对结果进行极差分析，以确定最佳的发酵条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T001表1L9（34）正交试验设计水平A料液比/(g/mL)B发酵温度/℃C发酵时间/hD接菌量/%11∶1.03548821∶1.237601031∶1.43972121.2.5粗多糖的测定发酵完成的中药转移至50 mL离心管中，蒸馏水定容至50 mL，80 ℃水浴30 min，5 000 r/min离心10 min，吸取部分上清液转移至1.5 mL离心管，12 000 r/min离心1 min。采用苯酚-硫酸法测定上清液中粗多糖的含量[10]。粗多糖含量(mg/g)=粗多糖浓度(g/L)×溶液体积(mL)×稀释倍数/底物质量(g)(1)1.2.6葡萄糖标准曲线的绘制参照实验室已有结果，490 nm吸收波长，采用分光光度计分别测定0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 g/L，共7个浓度的葡萄糖标准品吸光值，绘制标准曲线。葡萄糖标准曲线见图1。得到回归方程y=10.374x+0.028 4，R2=0.997 8。结果表明，葡萄糖的质量浓度在0.01~0.10 g/L与吸光度呈良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.F001图1葡萄糖标准曲线1.3数据统计与分析试验每组设置2个重复，采用SPSS 26.0软件进行数据处理，单因素筛选试验采用单因素ANOVA检验，采用Duncan's法对各组间平均值进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌种的筛选单菌发酵和双菌发酵对粗多糖含量的影响见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T002表2单菌发酵和双菌发酵对粗多糖含量的影响组别粗多糖含量/(mg/g)未发酵中药组118.52±15.60c单菌发酵1组（枯草芽孢杆菌）169.70±12.73ab单菌发酵2组（植物乳杆菌）165.70±0.85ab双菌发酵1∶9组179.40±2.97a双菌发酵2∶8组126.32±28.84bc双菌发酵3∶7组164.11±14.42ab双菌发酵4∶6组170.00±11.46ab双菌发酵5∶5组165.60±29.26ab双菌发酵7∶3组163.20±4.67ab双菌发酵9∶1组123.32±12.72c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05），下表同。由表2可知，双菌发酵结果中枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌1∶9组粗多糖的含量显著高于其他组，选择其为最优发酵菌种。发酵产物中粗多糖含量为179.4 mg/g，比未发酵组中粗多糖含量118.52 mg/g提高51.4%。2.2酶的筛选2.2.1接种酶对粗多糖含量的影响添加单酶和不同比例的双酶对粗多糖含量的影响见表3。由表3可知，单酶发酵组和双酶发酵组粗多糖含量均出现不同程度的提高。纤维素酶∶果胶酶3∶7组粗多糖的含量最高，选择该组合为最优酶添加比例。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T003表3添加单酶和不同比例的双酶对粗多糖含量的影响组别粗多糖含量/(mg/g)单酶发酵1组（纤维素酶）226.78±26.71ab单酶发酵2组（果胶酶）223.19±26.72ab双酶发酵1∶9组225.28±2.55ab双酶发酵2∶8组234.88±17.81ab双酶发酵3∶7组263.67±12.72a双酶发酵4∶6组225.28±46.65ab双酶发酵5∶5组236.08±3.39ab双酶发酵7∶3组199.79±41.14ab双酶发酵9∶1组189.30±26.30b2.2.2酶总添加量对粗多糖含量的影响（见表4）由表4可知，随酶添加量的增多，发酵液中粗多糖含量有上升趋势，总添加量达到150 U/g时粗多糖含量出现峰值，随后酶总添加量的增加与150 U/g组组间差异并不显著（P0.05）。为节约成本，选择150 U/g为酶总添加量，发酵产物中测得的粗多糖含量为271.47 mg/g，较未发酵组中粗多糖的含量提高129%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T004表4酶总添加量对粗多糖含量的影响组别粗多糖含量/(mg/g)25 U/g组206.39±14.84c50 U/g组223.78±3.82c75 U/g组230.08±11.03ab100 U/g组251.67±6.79ab150 U/g组271.47±15.27a200 U/g组269.37±4.66a300 U/g组270.86±11.02a2.3最佳发酵条件的筛选正交试验结果见表5、表6。由R值可知，影响结果的因素依次为ABDC（即料液比温度时间接菌量）；由k值可知，发酵条件的最佳组合是A2B1C2D3，即料液比1∶1.2 g/mL、发酵温度35 ℃、发酵时间60 h、接菌量12%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T005表5正交试验极差分析项目ABCD粗多糖/(mg/g)11111233.0821222235.4831333219.2842123288.2652231261.8762312258.2773132248.6783213236.0893321219.2811111237.8821222253.4731333230.0842123277.8752231271.4662312254.0773132254.6783213260.0793321229.48k1234.88256.74246.58242.18k2268.63253.07250.64250.77k3241.38235.08247.67251.94R33.7521.664.069.7610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.015.T006表6正交试验方差分析项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值A料液比3 849.24721 924.62324.8080.01B发酵温度1 612.9852806.49210.3960.01C发酵时间53.076226.5380.3420.05D接菌量341.2462170.6232.1990.05误差698.220977.580修正后总计6 554.77317注：F0.01=5.47，F0.05=3.23；P0.05表示差异不显著，P0.01表示差异极显著。3讨论3.1发酵菌种的选择不同的发酵菌种代谢产酶不同，发酵能力也不同，不同微生物间存在拮抗作用。因此，多菌发酵过程中菌种应根据各自的生物特性以及试验结果进行选择[11]。本试验选择的菌种为发酵常用菌，枯草芽孢杆菌生存环境多样，对营养及水分要求较低，可合成α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等酶类用于发酵，分泌枯草菌素、多黏菌素、抗菌肽等活性物质，抑制致病菌生长；植物乳杆菌在发酵过程中可产生有机酸，降低发酵底物pH值，抑制杂菌生长，改善食品风味[12]。本试验中，双菌发酵枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌1∶9组比单菌发酵效果好，原因可能是两者之间产生协同作用，对中药底物产生最佳的发酵效果[13]。3.2菌酶协同发酵的优势植物类中药纤维含量高，直接饲喂动物生物利用率低、适口性差，可通过微生物发酵作用提高其品质[14-15]。菌酶协同发酵是在微生物发酵基础上添加外来酶，酶水解后的底物能够更好地被菌体利用，形成正向促进作用，将菌种潜力和底物利用率提升到最大[16]。李家明等[17]研究表明，选用枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母与植酸酶混合发酵可以改善辣木茎秆粉的营养品质，降低抗营养因子植酸的含量。王田田等[18]通过比较混合菌种、混合菌和酶组合的发酵辣木茎叶粉效果，发现在双菌基础上添加蛋白酶更有助于提升辣木营养品质以及提高抗氧化活性成分。菌酶协同发酵过程中可添加不同的酶，即降解原料纤维的酶、抑菌酶、提高免疫力的酶以及降解有害物质的酶[19]。本试验添加酶可促进中药有效成分的析出，选择含有纤维素酶和果胶酶的降解植物细胞壁，并对这两种酶按比例组合，且按总接菌量进行筛选。3.3菌酶协同发酵条件优化的必要性发酵条件能够直接影响微生物的生长代谢，从而影响发酵效果和发酵产物的品质。影响微生物发酵的主要条件包括发酵时间、发酵温度、接菌量、料液比[20]。适宜的液体含量能够充当营养物质、氧气交换的媒介，起到维持微生物生长环境稳定的作用；温度的选择需要保证菌的正常生长，并考虑温度对酶活性的影响[21]；适宜的反应时间能够保证发酵菌种处于生长期或稳定期；适宜的接菌量能够使微生物在营养物质有限条件下更多发酵底物，防止菌种间的恶性竞争。因此，均衡发酵条件可发挥微生物的最大效益，得到更多的目的产物。徐孝宙等[22]通过优化接种比例、发酵温度和发酵时间条件，保证发酵产物中枯草芽孢杆菌数量的稳定。岳丽等[23]研究发现，在发酵时间5 d、酶菌混合比例1∶3、pH值4.5、温度40 ℃的条件下发酵甜高粱秸秆，粗蛋白质质量分数达15.51%，菌酶协同处理可以提高甜高粱秸秆的饲用品质。刘扬科等[24]通过对枯草芽孢杆菌YT168-6最适温度、接菌量等发酵工艺的优化，使发酵液中抗菌肽sublancin产量提高至优化前的2.09倍。发酵过程可筛选合适的增效剂，如蛋白胨、苯乳酸、某些无机盐等，为微生物的生长提供更充足的氮源、碳源及生长因子等营养物质。本试验仅选用了豆粕、葡萄糖两种廉价的添加物作为发酵菌种的营养来源。豆粕中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素及多种微量元素[25]，葡萄糖主要作为碳源利用。随着研究的深入，可尝试对固体培养基成分进行优化，使其更加适合菌群的生长。4结论菌酶协同发酵黄芪、绞股蓝、马齿苋复方中药最优工艺参数为：植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌接菌比例1∶9、纤维素酶和果胶酶接酶比例3∶7、酶总添加量150 U/g、发酵时间60 h、发酵温度35 ℃、接菌量12%。此条件下，发酵液中粗多糖含量平均为280.46 mg/g。