杂交构树（hybrid Broussonetia papyrifera）是中国科学院植物研究所沈世华团队研究出的无性良种组培苗。研究表明，杂交构树是在中国大部分地区均可种植的优质树种[1]。杂交构树生长速度快、饲用价值高；富含氨基酸、维生素等营养成分以及天然多糖类等生理活性物质，具有一定的药理活性，是一种良好的功能性饲料资源[2-3]。目前，杂交构树的研究主要在饲料青贮发酵方面居多[4-6]，关于杂交构树多糖的研究较少。严丹等[7]报道，杂交构树叶多糖提取工艺及抗氧化活性研究。但杂交构树叶多糖发酵工艺及抗氧化活性研究未见报道。酿酒酵母属于传统发酵菌株[8]。产阮假丝酵母在工业中是一种极为重要的微生物，常用于生产多种有用的生物物质。产朊假丝酵母的蛋白质和维生素B的含量比普通酿酒酵母高[9]。产阮假丝酵母作为一种安全菌种，能够在食品和制药业以及饲料行业应用。扣囊复膜孢酵母具有较强的产酶、糖化和产香产酯能力，是发酵行业研究的热点 [10]。清除自由基是表征抗氧化能力的重要指标。为了优化工艺条件、提高发酵效率，本研究选取1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，具有稳定性好、重复性强、使用范围广的特点[11]，可以作为杂交构树叶多糖抗氧化活性评价指标。本研究以杂交构树叶为原料，通过传统水提法制备杂交构树叶多糖发酵液，利用多糖含量、DPPH·清除率和铁离子还原能力，对3种酵母菌株进行比较分析，从而筛选出发酵菌种[12]，以期为提高杂交构树资源的综合利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂杂交构树叶购自河南省科学院构树工程技术研究中心。产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母、酿酒酵母均购自北纳创联生物技术有限公司。DPPH·清除能力试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；铁离子还原能力试剂盒购自上海琮益科技有限公司；总多糖含量试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；纤维素酶（50 000 U/g）购自上海罗恩试剂公司。化学试剂均为分析级试剂。1.2培养基酵母粉麦芽糖培养基（YM）：葡萄糖2 g、酵母粉0.4 g、蛋白胨1 g、麦芽提取物0.4 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min。1.3仪器设备T-9紫外可见分光光度仪购自北京普析通用仪器有限责任公司；YTC（W）-30电子秤购自上海亚津电子科技有限公司；一次性溶液过滤器（0.22 μm）购自天津市津腾实验设备有限公司；BILON3-120A超声波清洗器购自上海比朗仪器制造有限公司；FW-100粉碎机购自常州市国旺仪器制造有限公司；H2100R高速大容量冷冻离心机购自湖南长沙湘仪检测设备有限公司；XS10001L精密天平购自梅特勒-托利多集团；ST2100 pH值计；D-1-70全自动高压蒸汽灭菌锅购自北京发恩科贸有限公司；恒温磁力搅拌器购自深圳环宇科学仪器有限公司。1.4试验方法1.4.1菌种的选取选取酿酒酵母、产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母对杂交构树叶进行发酵，对各菌种发酵后的多糖含量进行测定，多糖样品的制备浓度为5 g/L，抗氧化活性试验。以未发酵样品为对照组，4次平行重复验证，筛选最佳菌株。1.4.2菌种生长曲线绘制选取抗氧化活性高的产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母，按照1%接种量接种于YM酵母培养基，设定不同的培养时间作为横坐标，设定响应的吸光度值（OD600 nm）为纵坐标，绘制生长曲线，观察菌种生长周期。1.4.3发酵前活化培养下的培养基碳氮比对菌种生长影响高碳氮比设计：氮源设为蛋白胨1 g，葡萄糖的添加量分别为（2、4、6、8、10 g）；低碳氮比设计：碳源设为葡萄糖2 g，蛋白胨的加入量分别为（1、2、3、4、5 g）。按照1%接种量接种于100 mLYM酵母培养基，25 ℃静置培养16 h，测定吸光值，观察菌种生长状况[13-14]。1.4.4正交试验设计通过从培养基碳氮比试验中获取葡萄糖含量和蛋白胨含量的数据以及菌种生长曲线中选取最佳条件，进行3因素3水平的正交试验，以菌种生长量（OD600 nm）为指标，L9(34)正交试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T001表1L9（34）正交试验因素水平因素水平A葡萄糖含量/(g/100 mL)B蛋白胨含量/(g/100 mL)C生长时间/h1411226216383201.4.5发酵原液制备以杂交构树叶为原料，通过水提工艺[15]条件，即液料比20 mL/g、温度70 ℃、提取3 h，提取杂交构树叶多糖。制备杂交构树叶多糖YM 200 mL发酵培养基；蒸馏水使用杂交构树叶多糖提取液代替，121 ℃下灭菌15 min，静置冷却，获得杂交构树叶多糖YM培养基。按照3%接种量加入酵母菌，25 ℃下静置培养55 h，获得杂交构树叶多糖发酵液（即发酵原液）。1.4.6多糖的制备发酵原液，加入相同体积的蒸馏水，稀释，75 ℃、80 W超声处理20 min；添加纤维素酶10 g/L，60 ℃加热70 min；5 000 r/min离心15 min取上清液；取新离心管，上清液与无水乙醇按1∶3混合，提纯过夜；5 000 r/min离心17 min，烘干，获得粗多糖。1.4.7多糖含量通过基于蒽酮-硫酸显色法[16]的总多糖含量检测试剂盒，测定葡萄糖标准曲线，葡萄糖标准液质量浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0 g/L）设定为横坐标，纵坐标为吸光度（OD540 nm），绘出标准曲线。1.4.8DPPH·清除能力根据试验所需量按照DPPH试剂∶无水乙醇体积比4∶21比例配制工作液。样本的制备：将新鲜样本置于60 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎，过30~50目筛；称取约0.05 g样本，加入1 mL提取液置于40 ℃水浴锅中浸提30 min；室温下10 000 r/min离心10 min，取上清液，置于冰上。避光、室温静置30 min，进行吸光度检测。DPPH·清除率=1-Ai-AjA0×100% (1)式中：Ai为DPPH试剂+样品溶液的吸光度；Aj为DPPH试剂+无水乙醇的吸光度；A0为DPPH试剂+样品稀释液的吸光度。1.4.9铁离子还原能力将0.2 mol/L磷酸缓冲液与1%铁氰化钾溶液按体积1∶1混合，取2 mL加入多糖样品50 ℃孵育20 min，冰浴冷却，取10%三氯乙酸1 mL混匀，3 000 r/min离心10 min，上清液中加入0.1%三氯化铁0.6 mL混匀，放置10 min，测定OD700 nm。空白对照不加样品液[17]。1.4.10单因素试验发酵时间分别为（24、36、48、60、72 h），菌种接种量分别为（1%、2%、3%、4%、5%），初始pH值分别为（3、4、5、6、7），培养温度为（23、25、27、29、31 ℃），评价指标设为杂交构树叶的DPPH清除率，考察发酵时间（A）、接种量（B）、初始pH值（C）及发酵温度（D）对发酵杂交构树叶多糖抗氧化活性影响。1.4.11响应面试验设计通过Box-Behnken试验设计[12]，获取单因素数据，优化杂交构树叶多糖发酵工艺，设定发酵时间（A）、接种量（B）、初始pH值（C）和发酵温度（D），发酵后的杂交构树叶多糖的DPPH自由基清除率为响应值（Y）。响应面试验因素水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T002表2响应面试验因素水平因素水平A发酵时间/hB接种量/%C初始pH值D发酵温度/℃-1362425054352717246292结果与分析2.1葡萄糖标准曲线（见图1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F001图1葡萄糖标准曲线采用Excel获得线性方程y=1.214 5x-0.006 1，相关系数R2=0.999 2，通过该线性方程计算发酵液中多糖含量。2.2发酵菌种的选取2.2.1菌种对杂交构树叶发酵后多糖含量的影响（见图2）由图2可知，与未发酵样品相比，采用3种菌株发酵杂交构树叶多糖浓度均显著提高。其中产朊假丝酵母发酵后的多糖含量最高，原因是产朊假丝酵母生长速度快，菌株密度大，产生胞外多糖量和自身携带胞外多糖相对较多[18]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F002图2菌种对杂交构树叶发酵后多糖含量的影响2.2.2菌种发酵多糖对抗氧化性能的影响（见图3）生长过程中，小分子糖为酵母菌株主要的碳源，酵母菌会将大分子糖水解为小分子糖，使裸露的羟基自由基较多，从而提高抗氧化活性[19-21]。由图3可知，发酵后多糖的抗氧化性高于发酵前，产朊假丝酵母发酵后多糖的抗氧化性显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F003图3菌种发酵多糖对抗氧化性能的影响2.2.3两种酵母菌的生长曲线（见图4）由图4可知，菌种生长到12 h时，产朊假丝酵母已进入对数增长后期，产朊假丝酵母的浓度显著高于扣囊复膜孢酵母菌株（P0.05）。菌种生长到36 h时，进入生长稳定期，产朊假丝酵母较之扣囊复膜孢酵母生长优势显著（P0.05）。因此，产朊假丝酵母发酵多糖含量高、抗氧化活性好、生长速度快、菌量浓度高。选取产朊假丝酵母为发酵菌种。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F004图4两种酵母菌的生长曲线2.3发酵前活化培养下的培养基碳氮比对菌种生长情况影响2.3.1高碳氮比对菌种生长情况影响（见图5）由图5可知，高碳氮比下的菌种产朊假丝酵母的生长量从添加葡萄糖的含量为6 g/100 mL以后开始下降，原因在于高浓度葡萄糖导致微生物细胞渗透失水，菌种缺水而死。少量添加葡萄糖菌种生长更旺盛[13]。因此，选取6 g/100 mL的葡萄糖含量为最优值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F005图5高碳氮比对菌种生长情况影响2.3.2低碳氮比对菌种生长情况影响（见图6）由图6可知，低碳氮比下，菌种产朊假丝酵母的生长量受到的影响较小。添加含量达到5 g/100 mL的蛋白胨时，酵母菌量受到抑制，原因是高含量的氮源会影响培养基的酸碱环境，对微生物生长产生不利影响[14]。选取2 g/100 mL的蛋白胨含量为最优值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F006图6低碳氮比对菌种生长情况影响2.4正交试验结果和方差分析2.4.1正交试验结果（见表3）由表3可知，各因素对菌量的影响顺序依次为：生长时间葡萄糖含量蛋白胨含量。最优组合为A3B3C3，通过对得到的最优组合参数条件进行3次重复验证试验，测得产朊假丝酵母菌量（OD600 nm）为2.38±0.025，优于试验结果所得最优组合（A3B1C3）。因此，发酵前活化培养下的菌种产朊假丝酵母的最优生长条件为葡萄糖含量8 g/100 mL、蛋白胨的含量3 g/100 mL、生长时间20 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T003表3正交试验结果试验号A葡萄糖含量/(g/100 mL)B蛋白胨含量/(g/100 mL)C生长时间/hOD600 nm11112.0121222.1131332.2142122.2152232.1762312.1373132.3183212.1693322.20k12.1102.1762.100k22.1702.1472.173k32.2232.1802.230R0.1130.0330.130优水平A3B3C3最优组合A3B3C3影响大小CAB2.4.2正交试验方差分析（见表4）由表4可知，葡萄糖含量、蛋白胨含量、生长时间对菌种产朊假丝酵母生长量无显著影响（P0.05）。各因素对菌种产朊假丝酵母生长量的影响程度为：生长时间葡萄糖含量蛋白胨含量，与表3结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T004表4正交试验方差分析方差来源偏差平方和自由度均方F值P值校正模型0.053a60.0098.6590.107A0.01920.0109.5380.095B0.00820.0043.8350.207C0.02520.13012.6040.074误差0.00220.001校正总计0.0558注：R2=0.963（R2Adj=0.852）。2.5发酵工艺优化单因素试验2.5.1发酵时间对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响（见图7）由图7可知，多糖对DPPH·清除率在24~48 h逐渐上升，原因是菌株生长加快，处于对数生长时期。发酵液中多糖对DPPH·的清除率在48 h后逐渐开始平稳。因此，发酵时间以48 h为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F007图7发酵时间对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响2.5.2接种量对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响（见图8）由图8可知，接种量小于3%时，杂交构树叶多糖对DPPH·的清除率随着接种量增加而提高。接种量为1%时，多糖对DPPH·清除率最低；接种量大于3%时，多糖对DPPH·清除率呈下降趋势；接种量3%时，多糖对DPPH·清除率最高。因此，接种量以3%为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F008图8接种量对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响2.5.3初始pH值对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响（见图9）由图9可知，初始pH值大于5.0时，多糖对DPPH·的清除率开始明显降低。初始pH值为5.0时，多糖对DPPH·清除率为各组最高。因此，初始pH值以5.0为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F009图9初始pH值对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响2.5.4温度对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响（见图10）酵母菌作为真核微生物的最佳适宜温度25~30℃[22]。由图10可知，27 ℃时，多糖对DPPH·清除率达到最大，该温度有利于酵母生长。因此，发酵温度以27 ℃为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F010图10温度对杂交构树叶多糖DPPH·清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T005表5Box-Behnken试验设计结果试验号A发酵时间B接种量C初始pH值D发酵温度DPPH·清除率/%10-10169.742-110064.023000079.5241-10067.105000078.6360-1-1066.307000079.288001-163.559-100167.1410110076.2211010-176.1212-10-1063.2513011061.481400-1-166.28150-10-170.5716000080.1817-100-164.4318001164.6019101068.09200-11058.302100-1165.4322000079.0223-1-10056.1024-101050.4925100179.342601-1069.402710-1071.7228010175.1029100-177.972.6发酵工艺优化响应面试验结果（见表5、表6）2.6.1Box-Behnken试验设计和结果在单因素试验结果基础上设定发酵时间（A）、接种量（B）、初始pH值（C）、温度（D）为自变量；设定DPPH·清除率（Y）为响应值，Box-Behnken设计4因素3水平试验。2.6.2回归方差分析试验二次回归方程为Y=79.33+6.25A+2.85B－2.99C+0.202 5D+0.3AB+2.28AC－0.335AD+0.02BC－0.047 5BD+0.475CD－6.13A²－5.55B²－10.75C²－1.83D²。由表6可知，本研究获取模型的响应值DPPH·清除率（Y）和自变量发酵时间（A）、接种量（B）、初始pH值（C）的线性关系显著。因此，可用于微生物发酵杂交构树叶多糖，提高抗氧化活性的理论预测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.T006表6回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型1 626.840 014116.200 018.830 00.000 1**A468.880 01468.880 075.960 00.000 1**B97.640 0197.640 015.820 00.001 4**C107.220 01107.220 017.370 00.000 9**D0.492 110.492 10.079 70.781 8AB0.360 010.360 00.058 30.812 7AC20.840 0120.840 03.380 00.087 5AD0.448 910.448 90.072 70.791 3BC0.001 610.001 60.000 30.987 4BD0.009 010.009 00.001 50.970 0CD0.902 510.902 50.146 20.707 9A²243.480 01243.480 039.450 00.000 1**B²200.110 01200.110 032.420 00.000 1**C²749.490 01749.490 0121.420 00.000 1**D²21.650 0121.650 03.510 00.082 2残差86.420 0146.170 0失拟项85.070 0108.510 025.260 00.003 5**纯误差1.350 040.336 8校正总和1 713.250 028注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。各因素对DPPH清除率的影响程度为：发酵时间（A）＞初始pH值（C）＞接种量（B）＞发酵温度（D）。2.6.3响应面及等高线分析（见图11）响应面曲线如果越陡，等高线图中间圆圈越圆，表明该DPPH清除率受到相应因素影响越大[23]。由图11可知，发酵时间（A）影响最大，依次是初始pH值（C）、接种量（B）以及发酵温度（D），与表6结果一致。根据响应面试验结果对各因素进行综合分析，各因素的交互项对试验结果的影响顺序为：ACCDADABBDBC。图11响应面及等高线分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a1（a）发酵温度和pH值对DPPH·清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a2（b）发酵温度和发酵时间对DPPH·清除率影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a3（c）pH值和接种量对DPPH·清除率影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a4（d）发酵温度和接种量对DPPH·清除率影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a5（e）pH值和发酵时间对DPPH·清除率影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.019.F11a6（f）接种量和发酵时间对DPPH·清除率影响2.6.4验证试验为了进一步确认最佳的发酵参数，通过响应面分析软件（Design-Expert 8.0.6）分析试验数据，获取最佳工艺参数：发酵时间58.3 h、接种量2.7%、初始pH值4、温度25 ℃。为了方便操作，本研究将最佳发酵工艺参数调整为：发酵时间60 h、接种量3%、初始pH值4、温度25 ℃。进行3次平行试验，实际测得杂交构树叶多糖DPPH清除率为78.84%，与预测值78.85%相比，相对误差小。因此，该响应面法的分析和结果准确可靠、回归模型合理、条件稳定，具有一定的实用价值。3结论本研究通过对多糖含量试验及抗氧化活性试验筛选出产朊假丝酵母作为发酵菌株，基于单因素参数设计正交试验，从而获得发酵前活化培养下的菌种生长最优条件：葡萄糖含量6 g/100 mL、蛋白胨的含量1 g/100 mL、生长时间为20 h。在单因素试验基础上进行响应面法设计，得到发酵杂交构树叶多糖最佳工艺：发酵时间60 h、接种量3%、初始pH值4、发酵温度25℃。在此最佳条件下，杂交构树叶多糖DPPH清除率达到78.84%。本研究为以后杂交构树叶相关产业发展和应用奠定基础。