副猪嗜血杆菌病（Haemophilus parasuis disease）也称格拉泽氏病（Glasser's disease）。副猪嗜血杆菌病的病原为副猪嗜血杆菌（Hacmophius parasuis，HPS），属巴斯德氏杆菌科嗜血杆菌属，为革兰氏阴性细菌，显微镜下形态呈小短杆至长丝状。2020年，经过详细的系统发育分析，副猪嗜血杆菌被重新命名为Glaesserella parasuis[1-2]。临床上该菌可感染仔猪和青年猪。发病猪表现为多发性浆膜炎、关节炎或脑膜炎等临床症状，成年猪多表现为隐性感染[3-4]。HPS对养猪业造成巨大的经济损失[5-6]。目前，养殖企业依靠抗菌药物治疗该病。但因抗生素的不合理使用，HPS对临床中常用的抗生素的耐药性愈发严重，抗生素残留也是动物性食品安全方面的重要隐患。自2020年7月1日起，我国已全面禁止在饲料中添加抗生素，力求养殖过程中减少使用抗生素，为社会提供安全、健康的动物性食品[7-8]。因此，亟须研究新的预防与治疗方法应对副猪嗜血杆菌病。本研究从猪场送检的病料中分离得到1株HPS菌株，按照参考文献[1]中报道的血清型鉴定方法对分离株进行血清型鉴定，该菌株属于血清7型HPS，为进一步研究HPS致病机理提供参考。1材料与方法1.1试验材料病料采自河南省南阳市某规模化猪场疑似感染HPS的病猪肺脏、胸腔积液。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）保存于河南科技学院预防兽医学实验室。1.2试剂与仪器主要试剂：烟酰胺腺嘌呤二苷酸（NAD）、2×Taq PCR Master Mix、胶回收试剂盒、DNA Marker，均购自北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆液体培养基（TSB）等相关的细菌培养基，均购自青岛高科技园区海博生物技术有限公司。主要仪器：Trobot PCR仪（Biometra公司）、凝胶成像系统（Bio-Rad公司）、Quanta 200扫描电子显微镜（FEI公司）、SW-CJ-1FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）、TG16-WS离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、HITACHI-1010离子溅射仪（日立公司）。1.3试验方法1.3.1细菌的分离、纯化培养及形态学观察送检的病猪肺脏、胸腔积液等病料经表面消毒，于超净工作台中采用无菌操作，分别接种于含5%胎牛血清与1% NAD的TSA培养基（以下简称TSA培养基），5%的CO2培养箱中37 ℃培养24~48 h，观察分离细菌的菌落形态，挑取针尖大小、透明光滑的露珠状可疑的菌落进一步纯化培养。将疑似HPS菌落的纯培养物采用无菌PBS稀释，分别接种于常见的细菌分离培养基（麦康凯培养基、普通琼脂培养基）进行初步分离鉴定，观察分离细菌的生长状况。于TSA培养基挑取可疑菌落进行细菌涂片、革兰氏染色，光学显微镜下观察，并将纯化后的细菌命名为NY2020株。1.3.2分离细菌的卫星试验将上述分离菌株于TSA培养基上划线培养，次日挑取单克隆于TSB液体培养基（含5%胎牛血清与1% NAD）中培养至对数生长期。无菌条件下，蘸取对数生长期的NY2020株菌液水平划线于绵羊鲜血琼脂平板上；将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌（ATCC25923）于分离株NY2020垂直方向划线，37 ℃继续培养24~36 h，观察分离株NY2020与金黄色葡萄球菌共同培养是否出现卫星生长的现象。1.3.3分离细菌的生化试验于超净工作台中，采用接种环取少量上述分离的细菌菌液接种于生化管中，向生化管中加入5 μL的NAD因子，采用液体石蜡密封细菌生化培养管，37 ℃恒温培养12~16 h，观察细菌生化反应管中的颜色变化。1.3.4分离细菌的PCR鉴定将1.3.1中分离纯化得到的分离株NY2020接种于TSB液体培养基，37 ℃ 250 r/min培养过夜；取少量接种于TSA固体培养基中，继续培养过夜；挑取透明、露珠状的单菌落接种于TSB液体培养基，37 ℃ 250 r/min培养至对数生长期，以培养菌菌液为模板进行PCR鉴定。1.3.5分离细菌的电镜观察将1.3.1中分离纯化得到的分离株NY2020接种于TSB液体培养基，37 ℃ 250 r/min培养过夜，3 000 r/min离心收集菌体；菌体经2.5%戊二醛固定、不同浓度乙醇进行梯度脱水（无水乙醇脱水2次）、叔丁醇再次干燥菌体、离子溅射仪喷金，于环境扫描电子显微镜下观察分离株NY2020细菌的形态。1.3.6分离细菌血清型鉴定及其系统进化树的建立根据参考文献[1]报道的HPS血清型多重PCR鉴定方法，设计应用于鉴定HPS 16S rRNA的特异性鉴定引物HPS-UP或HPS-DP，结合目前国内流行的HPS血清型，设计应用于鉴定分离株血清型的一系列鉴定引物。以纯化的NY2020株菌液为模板，采用HPS-UP或HPS-DP和HPS血清型鉴定引物分别扩增分离菌的16S rRNA和funQ基因，将得到的PCR产物进行电泳检测，初步鉴定为阳性的样品送往生工生物工程（上海）技术服务有限公司进行测序。将所测得的分离株的funQ基因序列与NCBI中已登录的其他HPS参考株的序列进行同源比对并构建系统进化树。2结果与分析2.1分离株的分离纯化与形态观察（见图1）由图1（a）可知，将疑似HPS感染的猪病料样品接种于TSA培养基上，培养24 h后，可见半透明、针尖状、露珠样菌落。由图1（b）可知，将分离菌进行革兰氏染色后，于普通光学显微镜油镜下观察，菌体呈红色，可初步判断分离细菌为革兰氏阴性菌；细菌呈短杆状分散排列。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.F001图1分离株的菌落形态和染色鉴定Fig.1Colony morphology and staining identification of isolated bacteria将分离菌接种于常见的细菌分离培养基（麦康凯培养基和普通琼脂培养基）中，细菌无法生长。初步判定该分离菌的形态及革兰氏染色与HPS相符，将纯化后的细菌命名为NY2020株。2.2分离株NY2020的卫星试验鉴定结果（见图2）由图2可知，与金黄色葡萄球菌接近的分离株NY2020的菌落较大，离金黄色葡萄球菌较远的分离株NY2020的菌落较小，说明金黄色葡萄球菌在生长过程中可为分离株NY2020提供必需的生长因子，符合HPS细菌的生长特性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.F002图2分离株NY2020的卫星试验结果Fig.2Satellite growth phenomenon result of isolated strain NY20202.3分离株NY2020的生化试验鉴定结果（见表1）将分离菌株接种于含NAD因子的生化微量鉴定管，5% CO2 37 ℃条件下培养24 h。生化特性表明，该分离菌无法分解硫化氢、乳糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、甘油醇、葡萄糖。参考《伯杰细菌鉴定手册》中HPS的生长特性，该菌生化鉴定结果基本符合HPS菌的生化培养特征。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.T001表1分离株NY2020的生化试验鉴定结果Tab.1Biochemical test identification results of isolated strain NY2020项目结果硫化氢-乳糖-肌醇-蔗糖-麦芽糖-甘油醇-葡萄糖-注 ：“-”表示阴性。2.4分离株NY2020的PCR及血清型鉴定（见图3）由图3可知，采用HPS通用型引物于821 bp处可以扩增得到一条清晰的核酸条带，采用7型HPS特异型性引物在490 bp处可见一条清晰条带，与预期结果一致，确定该分离株NY2020为血清7型HPS。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.F003图3分离株NY2020的PCR鉴定Fig.3PCR identification of isolated strain NY2020注 ： M为DL2000 DNA Marker；1为分离株HPS 16S rRNA扩增；3为分离株的funQ扩增；2、4均为阴性对照。2.5分离株NY2020的扫描电镜观察结果（见图4）由图4可知，分离株NY2020经固定、脱水、干燥、喷金处理，在扫描电子显微镜观察下观察细菌形态，菌体呈短杆、长杆状。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.F004图4分离株NY2020的扫描电镜观察结果Fig.4Scanning electron microscope observation results of isolated strain NY20202.6分离株NY2020 16S rRNA的系统进化分析（见图5）由图5可知，分离株NY2020 16S rRNA与GenBank中HPS（登录号：AY126705.1）序列的同源性为100%，与血清7型HPS AY126705.1株为同一分支，进一步证实了该分离株NY2020为血清7型HPS。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.002.F005图5分离株NY2020的系统进化树Fig.5Phylogenetic tree of isolated strain NY20203讨论感染HPS可导致感染猪出现食欲减退、关节肿胀、呼吸困难、鼻腔有分泌物排出、流产以及共济失调等症状，严重可导致死亡；仔猪感染后可在短时间内发病，病死率高；急性发病康复后的仔猪有可能出现慢性关节炎等症状，严重影响猪后期的生长速度，延长猪的育肥周期，降低饲料转化率，影响企业的经济效益[2-3]。HPS对营养要求相对较高，临床中分离该菌相对较为困难。本研究对送检样品进行初步的流行病学分析，并针对性地采用含有NAD因子和胎牛血清的TSA培养基进行HPS的分离，成功从送检病料中分离得到1株HPS。与传统的细菌分离方法相比，该分离方法降低了因HPS生长缓慢而容易被其他杂菌竞争性抑制而造成分离失败的风险，提高了HPS的分离效率。HPS具有多种血清型。传统的HPS血清型鉴定方法需要实验室中储备各种血清型的标准样品，加大了临床中该菌的血清型鉴定难度，延长了鉴定时间[9-10]。本试验依据已报道的HPS PCR鉴定方法[11]，参考当前国内流行的HPS血清型，采用HPS通用鉴定引物，确定所分离的细菌为HPS；采用血清型特异的鉴定引物进行多重PCR，确定分离细菌的血清型。通过上述操作可快速鉴定所分离HPS的血清型，操作方法简单且不易受外界条件的干扰。HPS主要有15种血清型，其中以4、5、13型HPS最为常见。HPS不同血清型之间细菌的毒力不尽相同，3、6、7、9和11型为无毒力菌株，感染猪群后不会导致猪群产生临床症状[12]。Ruiz等[13]研究发现，副猪嗜血杆菌毒力与膜蛋白有关。抗生素是预防和治疗HPS感染以及各种细菌性疾病的常用手段，但因耐药性和药物残留等问题，选择适合的敏感药物替代抗生素将成为主要策略。疫苗预防仍然是预防传染病最经济有效的手段，但目前主要研究的多为4型、5型、12型和13型灭活疫苗[14]。副猪嗜血杆菌血清型多且不同菌株毒力存在差异，尚无1种灭活菌苗同时可对所有的致病菌株产生交叉保护力。因此，研制具有交叉保护意义的HPS疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病必然要求。4结论本试验成功分离并鉴定了一株血清7型HPS，进一步丰富了HPS的菌株资源，为研发具有交叉保护作用的HPS疫苗提供了素材。