仔猪断奶时期，日粮转换、肠道发育未完全以及生活环境的变化[1]等因素易引起断奶应激，造成肠道屏障功能障碍等问题，引发腹泻，进而影响仔猪的生长性能，导致仔猪淘汰，甚至死亡[2-3]。日粮添加ZnO是提高仔猪的生产性能、减少腹泻的常见解决方法。但长期使用ZnO不仅影响仔猪的健康，Zn随仔猪粪便排放至土壤中还会造成环境污染，诱导土壤中微生物产生耐药性[4-6]。饲用植物及海藻的成分具有清除自由基抗氧化、广谱抗菌、抗腹泻等生物活性[7-9]。海带的类胡萝卜素具有抗氧化、免疫调节等作用[10]；海带多糖具有调节血脂血糖代谢、益生元等作用[11]。番薯富含黄酮类物质、酚类化合物（β-胡萝卜素）及维生素A，具有较好的抗氧化作用[12]。Parveen等[13]研究发现，甜薯中三叶豆苷能够通过改善肠道屏障功能，治疗腹泻和胃病。盐肤木浓缩提取物富含药用价值，能够有效清除自由基，改善动物机体抗氧化能力，抑制肝细胞凋亡[14-16]。植物及藻类提取物具有抗氧化、抗菌、驱虫、提高免疫力等[17-18]生物学功能。本试验采用海带-番薯-盐肤木复合植物藻类提取物（CPAE）替代日粮中ZnO，研究其对断奶仔猪生长性能、腹泻、肠道发育、免疫指标及锌的排放等的影响，以期研究CPAE对肠道屏障功能的影响机制，为养猪业ZnO的替代提供参考。1材料与方法1.1试验材料CPAE产品由海带、番薯、盐肤木复合提取物和无机填充物组成；CPAE产品中含10% CPAE，购自广东华膳康生物工程科技有限公司。三氧化二铬（分析纯）购自上海麦克林生化科技有限公司。1.2试验设计选取28日龄体重为（8.20±1.78）kg的“长×大”二元第一胎断奶仔猪24头，随机分为2组，每组6个重复，每个重复2头猪。ZnO组为添加2 kg/t ZnO的基础日粮，CPAE组为添加1 kg/t CPAE产品的基础日粮。试验期14 d。试验采用教槽期基础日粮，参照NRC（2012）10~20 kg体重仔猪营养需要进行生产。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米38.0消化能/(MJ/kg)14.84膨化玉米13.5粗蛋白质/%18.02豆粕3.0粗脂肪/%4.75膨化大豆12.0粗灰分/%4.26蒸汽鱼粉3.5赖氨酸/%1.21面粉6.5蛋氨酸/%0.38乳清粉7.5苏氨酸/%0.93发酵豆粕5.0色氨酸/%0.25葡萄糖5.0蛋氨酸+半胱氨酸/%0.68预混料6.0钙/%0.46总磷/%0.58有效磷/%0.40注：1.每千克预混料为克日粮提供：铁3 668 mg、铜1 833 mg、锌2 083 mg、锰583 mg、VA 240 000 IU、VD3 75 000 IU、VE 2 300 IU、烟酸750 mg、泛酸钙420 mg、VB2 150 mg、VB6 120 mg、生物素6 mg。2.营养水平为计算值。1.3饲养管理本试验于2020年12月下旬至2021年1月上旬，化州市丽岗种猪场进行。试验仔猪统一饲养于一栋保育舍内，每个重复饲养于一个栏舍内。试验期间通过保温灯和通风系统保证温湿度处于较适宜的区间内，舍内灯光适宜，饲养管理按照猪场正常管理程序进行，每日喂料3~5次，自由饮水。1.4样品采集1.4.1饲料样品分别于第1、7和14 d，四分法收集两组饲料各100 g，-20 ℃保存，用于检测外源性指示剂Cr₂O₃和饲料中的养分值。1.4.2粪便样品正式试验第10 d起为粪样收集期，连续3 d，每日进行地面晨扫，喂料，9：00、15：00收集无尿液及其他杂质污染的新鲜粪样100 g，加10 mL 10%盐酸混匀，-20 ℃保存，检测表观消化率指标。1.4.3血清样品试验结束每个重复随机挑选1头仔猪，禁食12 h后前腔静脉采血。采集非抗凝血5 mL静置1 h，3 000 r/min离心分装血清，-80 ℃保存，检测血清免疫指标。1.4.4肠道组织与黏膜样品处死仔猪，采集仔猪十二指肠、空肠、回肠中段、结肠样品，每份长度2 cm，加入4％多聚甲醛固定，石蜡切片及H&E染色，评价仔猪肠道形态；刮取十二指肠、空肠和回肠中段肠黏膜约2 g，液氮-80 ℃保存，检测肠道细胞因子及肠道屏障相关基因的mRNA相对表达量。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能与腹泻率试验第1 d和最后1 d，对每只仔猪进行称重（称重前空腹12 h）。每日准确记录饲料采食量，根据平均日增重和平均日采食量计算料重比，9：00、15：00观察仔猪腹泻情况。参照Marquard等[19]的方法进行腹泻评分。腹泻评分标准：粪便质地硬，呈干燥颗粒状，正常粪便，记1分；粪便质地硬，少量水分成形，正常粪便，记2分；软便，能成形，但水分含量较高，轻度腹泻，记3分；粪便黏稠，不成形，腹泻，记4分；粪便呈液状，不成形，或有粪水分离的现象，严重腹泻，记5分。平均日采食量=试验期间总耗料量/试验天数(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)料重比=总耗料量/总增重(3)腹泻率=(仔猪腹泻头数/仔猪头数×试验天数)×100%(4)1.5.2营养物质表观消化率外源性指示剂Cr₂O₃的检测方法参照国家标准（GB 5 009.123—2014）的方法，利用原子吸收光谱仪测定饲料和粪便中Cr元素的含量，换算得到指示剂的含量，计算日粮中某养分的消化率（D）。D=(1-A₁/A×B/B₁)×100%(5)式中：D为营养物质表观消化率；A为试验日粮中该营养成分的含量；A₁为仔猪粪便中营养物质的含量；B为试验日粮中Cr₂O₃的含量；B₁为粪便中Cr₂O₃的含量。1.5.3血清指标仔猪血清中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）均采用ELISA检测试剂盒进行含量检测，购自江苏酶免实业有限公司。采用天门冬氨酸底物法检测谷草转氨酶（AST）的活性，丙氨酸底物法检测谷丙转氨酶（ALT）的活性，NPP底物-AMP缓冲液法检测血清中碱性磷酸酶（ALP）活性，溴甲酚绿法测定血清中的白蛋白（ALB）含量、双缩脲法检测血清中总蛋白（TP）的含量；试剂盒购自深圳雷杜生命科学股份有限公司，Chemray 800全自动生化分析仪来自深圳雷杜生命科学股份有限公司，操作步骤按照试剂盒说明书进行。1.5.4仔猪各肠段肠道形态空肠、十二指肠以及回肠样品，脱水，石蜡包埋，切片，H&E染色，封片。采用Eclipse Ci-L图像采集仪器（Nikon）及Image-Pro Plus 6.0浏览分析软件，测量每张切片中5根完整绒毛高度、隐窝深度并计算绒隐比。绒隐比=绒毛高度/隐窝深度(6)1.5.5肠道细胞因子及肠道屏障相关基因的mRNA相对表达量采用实时荧光定量PCR方法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Ⅱ型干扰素（IFN-γ）、肠黏膜闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、闭锁蛋白（Occludin）、跨膜蛋白（Claudin）的mRNA相对表达量。RNAiso Plus试剂盒提取回肠黏膜组织总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度，记录数据。按照HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR试剂盒说明配制反应液，完成反转录，合成cDNA，-20 ℃保存。以反转录的cDNA为模板扩增基因，反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；反应结束60~95 ℃熔解曲线分析。各指标基因mRNA相对表达量的测定，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为参考基因，相对定量△△Ct分析，2△△Ct法计算各组基因的mRNA相对表达量。Premier 5.0设计基因引物序列，基因引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T002表2基因引物序列基因引物序列(5'→3')产物大小/bp登录号GAPDHF：TACACTGAGGACCAGGTTGTGR：TTGACGAAGTGGTCGTTGAG101NM_001206359.1TNF-αF：CTGTAGGTTGCTCCCACCTGR：GAGGTTCAGCGATGTAGCGA137NM_214022.1TNF-βF：CCTCAGCGCTCAGAAGTCCR：AGGCTCCAAAGAAGACGCTAC164NM_214453.1IFN-γF：CAGGCCATTCAAAGGAGCATR：GAGTTCACTGATGGCTTTGCG150NM_213948.1ZO-1F：CCAAGATCCGATAGGCGGTCR：GCCATCTCTTGCTGCCAAAC159XM_021098827.1OccludinF：CAGGTGCACCCTCCAGATTGR：ATGTCGTTGCTGGGTGCATA167NM_001163647.2ClaudinF：GGACAAAACCGTGTGGGAACR：GCCCTCTCCCCACATTCG248NM_001244539.11.6数据统计与分析数采用SPSS 18.0进行统计分析，独立样本t检验。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1CPAE对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响（见表3）由表3可知，两组仔猪的末重平均日增重、平均日采食量、料重比以及腹泻率均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T003表3CPAE对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响项目初重/kg末重/kg平均日增重/[kg/(只·d)]平均日采食量/[kg/(只·d)]料重比腹泻率/%P值0.5570.7480.5300.8560.3770.814ZnO组8.390±0.50011.360±0.4200.211±0.0170.327±0.0131.597±0.1307.700±0.043CPAE组8.000±0.41011.170±0.3700.226±0.0140.324±0.0141.451±0.0888.900±0.0242.2CPAE对断奶仔猪营养物质表观消化率及锌排放的影响（见表4）由表4可知，CPAE可使仔猪的粗蛋白表观消化率提高5.41%，粗脂肪消化率提高了0.97%（P0.05）；CPAE组粪便中锌含量排极显著低于ZnO组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T004表4CPAE对断奶仔猪营养物质表观消化率及锌排放的影响项目粗蛋白质粗脂肪锌P值0.1510.7230.000ZnO组69.88±0.0277.67±0.140.84±0.03CPAE组75.29±0.0378.64±0.230.10±0.00注：粪便中锌含量以锌元素计。%2.3CPAE对断奶仔猪血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，与ZnO组相比，CPAE组仔猪血清中的ALP、ALT活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T005表5CPAE对断奶仔猪血清生化指标的影响组别ALP/(U/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)TP/(g/L)ALB/(g/L)P值0.0020.0020.0800.6290.865ZnO组553.82±24.15111.67±6.6278.52±8.5250.26±1.3735.28±0.94CPAE组335.39±44.9667.92±7.9058.12±6.0651.36±1.6734.93±1.802.4CPAE对断奶仔猪血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，CPAE组仔猪血清中的IgA、IgG含量显著高于ZnO组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T006表6CPAE对断奶仔猪血清免疫指标的影响组别IgAIgG/IgMP值0.0000.0000.488ZnO组0.82±0.018.03±0.110.95±0.01CPAE组0.96±0.039.02±0.100.96±0.01g/L2.5CPAE对断奶仔猪肠道形态的影响（见表7）由表7可知，与ZnO组相比，CPAE组仔猪的十二指肠隐窝深度显著降低（P0.05），绒隐比显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.T007表7CPAE对断奶仔猪肠道形态的影响项目ZnO组CPAE组P值空肠绒毛高度/μm261.18±19.95288.21±20.680.379隐窝深度/μm185.33±25.75135.30±9.000.079绒隐比1.55±0.282.16±0.160.082十二指肠绒毛高度/μm371.51±29.55344.14±27.170.511隐窝深度/μm231.25±19.81164.31±18.220.032绒隐比1.63±0.132.14±0.110.015回肠绒毛高度/μm264.21±26.27320.53±26.780.164隐窝深度/μm137.01±7.28146.81±9.100.420绒隐比1.95±0.192.18±0.130.3412.6CPAE对断奶仔猪各肠道免疫因子及紧密连接蛋白的表达的影响（见图1）由图1可知，无论是在空肠、十二指肠还是回肠中，各免疫因子的含量变化均无显著差异（P0.05），但CPAE组仔猪空肠和十二指肠中Ⅱ型干扰素（γ-IFN）的表达量低于ZnO组（P0.05）。在紧密连接蛋白方面，CPAE组和ZnO组的断奶仔猪肠道中肠黏膜闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、闭锁蛋白（Occludin）、跨膜蛋白（Claudin）表达量均无显著差异（P0.05），CPAE组断奶仔猪空肠中Claudin、十二指肠中Occludin、回肠中ZO-1和Occludin的表达量仅在数值上高于ZnO组。图1CPAE对断奶仔猪空肠、十二指肠、回肠中免疫因子及紧密连接蛋白的表达的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.F1a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.005.F1a33讨论3.1CPAE对断奶仔猪生长性能的影响海藻及植物提取物具有增加采食量、降低腹泻次数和料重比的功能[17-18,20-24]。植物提取物的原料选择、提取工艺和条件[25]及使用剂量[26]的差异，均可对其功效产生巨大影响。单一植物提取物的作用效果具有局限性，复合植物提取物的作用是其几种单一植物提取物的综合效果[27]。陶新等[28]研究表明，CPAE对断奶仔猪的生长性能具有提高的趋势。本研究在日粮中添加1 kg/t CPAE替代2 kg/t ZnO，两组仔猪的生长性能及腹泻率无显著性差异。3.2CPAE对断奶仔猪营养物质表观消化率及锌排放的影响饲料中添加锌元素能够显著改善促进断奶仔猪营养物质的消化率。王敏奇等[29]研究发现，断奶仔猪的日粮中添加高剂量无机锌能够提高日粮的粗蛋白质和粗脂肪的消化率。朱宇旌等[30]在日粮中添加1 800 mg/kg的包被ZnO能够显著提高饲料粗蛋白和粗脂肪的消化率。Debski等[5]指出，日粮中添加高剂量ZnO会导致锌元素在土壤中积累，造成土壤和水资源严重污染。本试验中，CPAE在提高断奶仔猪消化率方面的功能与高剂量ZnO相当，能够替代ZnO促进仔猪对养分的消化吸收，降低仔猪锌元素排放量，缓解环境污染情况。3.3CPAE对断奶仔猪血清生化指标的影响仔猪断奶产生的氧化应激会对仔猪的免疫机能、肝脏功能等造成多重危害[18,31-33]。刘通[34]研究表明，氧化应激会导致仔猪的ALT和AST的活性升高，表明仔猪肝脏功能受损。本试验将断奶仔猪日粮中的ZnO替换为CPAE之后，仔猪的ALT活性极显著降低，AST也有降低的趋势，说明CPAE能够缓解断奶造成的氧化应激，保护肝脏功能，促进断奶仔猪的生长发育。3.4CPAE对断奶仔猪免疫功能的影响免疫球蛋白由B淋巴细胞分泌产生，分为IgA、IgE、IgG、IgM和IgD，可介导动物机体的体液免疫[35]。血清中起重要免疫功能的免疫球蛋白是IgG、IgA和IgM[36]。免疫球蛋白在致病菌或者病毒等抗原入侵时，可转化为抗体产生各类免疫反应抵抗抗原[37]。仔猪断奶后，失去了母源性免疫球蛋白的供应，且断奶应激造成炎症反应，抑制自身免疫球蛋白的产生[38]。本试验中，CPAE组仔猪血清中的IgA和IgG的含量显著高于ZnO组，IgM的含量有偏高的趋势；表明与ZnO相比，CPAE能够更好地促进断奶仔猪产生免疫球蛋白，增强断奶仔猪的免疫力，使仔猪能够更好地适应养殖场环境。3.5CPAE对断奶仔猪肠道形态的影响断奶仔猪日粮中存在的抗营养物质会刺激肠道绒毛萎缩及隐窝深度增加，降低仔猪肠道的绒隐比，降低蛋白质的消化率[39]。Pluske等[40]研究表明，仔猪受到断奶应激的影响，易促进肠道绒毛萎缩和隐窝增生，降低仔猪的生长性能。肠道绒毛的长度、隐窝深度及绒隐比能够反映仔猪肠道的健康度和完整性[41]。邵青玲等[42]研究表明，日粮中单独添加海带多糖能够显著提高十二指肠绒毛高度及绒隐比，与本试验的结果一致。本试验结果表明，CPAE能够显著降低十二指肠的隐窝深度，并显著提高其绒隐比；与ZnO相比，CPAE能够更好地改善仔猪的肠道形态，保持肠道绒毛的完整性，防止隐窝增生，进而提高仔猪的消化吸收能力，促进仔猪生长。3.6CPAE对断奶仔猪对肠道免疫因子含量及紧密连接蛋白的表达的影响作为补充代谢因子，肿瘤坏死因子不仅可能诱发炎症细胞因子产生，还可能进一步参与疾病的发生和发展[43-44]。符清瑶等[45]研究表明，受到断奶应激的影响，断奶仔猪肠道中黏膜炎症因子（IL-1β和TNF-α）的mRNA表达量均有提高。本试验中，CPAE组断奶仔猪肠道内TNF-α的表达量略高于ZnO组，但并不构成显著差异；空肠和十二指肠中γ-IFN的含量更低。结果表明，在断奶后缓解仔猪氧化应激方面，CPAE与ZnO具有相似的效果。肠道黏膜是由紧密连接蛋白连接黏膜细胞构成的屏障，不仅负责吸收营养和分泌代谢产物，也是机体抵抗病原入侵的屏障[46]。ZO-1、Occludin、Claudin等紧密连接蛋白能够很大程度反映肠道黏膜屏障的健康程度。Zhang等[47]研究指出，ZnO能够增加回肠内ZO-1、Occludin的表达量，降低肠道通透性。本试验中，CPAE组断奶仔猪各肠道中的各个紧密连接蛋白的mRNA表达量均与ZnO组仔猪无显著差异。结果表明，CPAE与ZnO具有类似功能，可降低促炎因子的表达量，提高肠道黏膜紧密连接蛋白的表达量，维护肠道屏障功能。4结论CPAE（含海带、番薯、盐肤木）能够起到与ZnO类似的抗腹泻、促生长以及维护肠道黏膜健康的功能，能够更好地提高断奶仔猪的免疫力，降低断奶应激造成的肝脏功能受损、维持肠道形态，CPAE具有替代ZnO的潜在应用价值。