水体中氨氮的含量超过鱼类所能承受的浓度时，即可引起鱼体氧化应激，严重时甚至造成死亡[1]。饵料中添加抗氧化剂如维生素C和E等可有效缓解如氨氮等环境胁迫引起的氧化应激[2-3]。硫辛酸（LA）也称α-硫辛酸，是一种天然化合物，具有较强的抗氧化性能。硫辛酸最早自猪肝脏中分离获得[4]。硫辛酸为万能抗氧化剂，进入机体后可直接作用于活性氧自由基（ROS），减少其含量并协助体内其他抗氧化剂再生，还可螯合金属离子，缓解金属离子对机体的氧化损伤[5]。当添加量相同时，硫辛酸的抗氧化能力远高于维生素E[6]。动物体内的硫辛酸不仅能够增强多种组织和器官的抗氧化能力，保护器官免受氧化应激的影响[7-9]，还能够参与调控机体对糖、蛋白质和脂类物质的代谢，改善动物肌肉品质及健康状况[6]。有报道指出，硫辛酸可显著提高动物体各组织中抗氧化酶的酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）等，提高非酶抗氧化剂如还原型谷胱甘肽（GSH）等的含量[10-12]。大口黑鲈是一种优质淡水肉食性鱼类，生长速度快、养殖周期短、适应性强且肉质鲜美，已成为我国重要的淡水养殖品种之一。前期研究发现，注射硫辛酸可提高大口黑鲈血清和肝脏的抗氧化酶活性[13]。为进一步明晰硫辛酸对大口黑鲈抗氧化应激的作用，本研究采用含硫辛酸的饵料饲喂大口黑鲈，分析其对氨氮胁迫下大口黑鲈氧化应激的影响，为进一步拓展硫辛酸缓解鱼类氧化应激的作用机理提供参考。1材料与方法1.1试验材料硫辛酸（含量99%，西安泽邦生物科技有限公司）。参考Kütter等[14]的方法配置硫辛酸溶解液（2 mmol/L NaOH、154 mmol/L NaCl），调整pH值至7.4，硫辛酸溶解，终浓度为4 g/L。每100 g饵料以10 mL硫辛酸溶液喷洒拌匀，饵料中硫辛酸含量为400 mg/kg，阴凉处晾干，4 °C保存。总蛋白（TP）、SOD、CAT、丙二醛（MDA）、GSH测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。1.2试验设计大口黑鲈购自西安草滩渔场，3%氯化钠溶液浸泡消毒试验鱼10~15 min，放入预先消毒的30 L水箱内，饲养驯化2 w。试验前1 d停止投喂，挑选健康且体重为（39.72±8.10）g的大口黑鲈84尾，随机分为对照组（饵料拌有不含硫辛酸的溶解液）和处理组（拌有硫辛酸，含量为400 mg/kg）。每个试验组设置3个重复，每个重复放置14尾鱼。每日9：00和16：00投喂，每组鱼采食量相近，观察记录鱼的摄食情况，饲料在水面漂浮超过5 min，无鱼采食停止投喂，清理漂浮残饵。每日饲喂后30 min换水，换水量不超过总水量的1/4，水温保持26~28 ℃，每日测定水体pH值，使其维持在7.2~7.5。1.3氨氮胁迫试验饲养试验结束，全部鱼进行氨氮胁迫。参考Egnew等[15]所获得的大口黑鲈氨氮96 h半致死浓度，设定本试验氨氮胁迫试验的总氨氮浓度为8.3 mg/L（以碳酸氢铵计）。以碳酸氢铵配制母液（浓度为10 g/L），根据养殖水箱中水的体积加入母液，使对照组和处理组养殖水箱中水体氨氮浓度为8.3 mg/L，开始氨氮胁迫试验。每12 h对水体中氨氮浓度进行测定，出现偏差及时作出调整，保证每组水体中氨氮浓度维持在8.3 mg/L，胁迫周期为48 h，期间不饲喂。1.4样品采集试验鱼进行氨氮胁迫期间，取样时间点为胁迫后的6、12、24和48 h，每个重复每次取样3尾，记录鱼体的体长和体重，50 mg/L的MS-222（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶液麻醉。自鱼体尾椎静脉采集血液，4 ℃静置4~6 h，于4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，吸取血清部分转移至新管，-20 ℃保存。解剖采集血液后的试验鱼获得肝脏组织，称重，按照1∶9的体积比加入生理盐水，冰水浴中充分研磨，3 000 r/min离心10 min，取上清部分，-20 ℃保存。1.5测定指标及方法大口黑鲈肝脏和血清的T-SOD、CAT的活性以及MDA含量、GSH含量以及肝脏TP含量等指标均按照试剂盒说明书进行测定。1.6数据统计与分析数据采用Excel 2019软件整理，SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。采用t检验分析组间差异，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1氨氮胁迫对大口黑鲈血清氧化应激相关酶的影响（见表1）由表1可知，与受胁迫前鱼体各项指标相比，氨氮胁迫后的大口黑鲈血清中T-SOD和CAT的酶活性呈升高趋势；氨氮胁迫6 h时，T-SOD活性显著提高（P0.05），但随后活性开始下降；氨氮胁迫6~12 h，CAT在酶活性显著升高（P0.05），随后活性下降，至48 h与受胁迫前鱼无显著差异（P0.05）；氨氮胁迫12~48 h，血清MDA含量均有所升高，以48 h时活性最高（P0.05）；氨氮胁迫对血清中GSH含量无显著性影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.012.T001表1氨氮胁迫对大口黑鲈血清氧化应激相关酶的影响胁迫时间T-SOD/(U/mL)CAT/(U/mL)MDA/(mg/L)GSH/(mg/L)0104.70±1.20ab13.12±1.69ab1.41±0.31a3.50±0.506 h115.54±8.48c17.89±1.24c2.37±1.30ab2.75±0.5012 h106.16±1.24bc16.33±1.21c1.98±0.15b3.37±0.5424 h103.97±2.71ab15.28±0.78bc2.72±0.59b3.54±0.3148 h97.65±5.84a10.71±3.18a4.76±2.08b2.33±1.06注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2氨氮胁迫对大口黑鲈肝脏氧化应激相关酶的影响（见表2）由表2可知，与受胁迫前相比，氨氮胁迫使大口黑鲈肝脏T-SOD和CAT的酶活性均有所升高；胁迫后6、48 h时，T-SOD活性显著升高（P0.05）；CAT在胁迫12~24 h范围内酶活性显著升高（P0.05）；肝脏MDA含量在氨氮胁迫24 h内并无显著性变化，胁迫48 h时含量显著升高（P0.05）；氨氮胁迫对肝脏GSH含量无显著性影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.012.T002表2氨氮胁迫对大口黑鲈肝脏氧化应激相关酶的影响胁迫时间T-SOD/(U/mg prot)CAT/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)GSH/(mg/g prot)0113.85±7.36c20.87±3.33b1.98±0.09b12.82±2.376 h175.44±27.31a27.30±3.44ab1.60±0.39b15.71±2.7412 h107.81±28.23bc34.60±4.64a1.40±0.42b12.85±3.6724 h113.67±27.91bc33.90±7.63a1.60±0.89b13.16±2.4648 h148.99±19.83ab26.68±6.38ab9.87±1.87a11.56±2.232.3硫辛酸对氨氮胁迫下大口黑鲈血清抗氧化指标的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，氨氮胁迫12~24 h，处理组T-SOD酶活力均显著高于对照组（P0.05）。氨氮胁迫48 h，处理组血清CAT酶活性显著升高（P0.05），在氨氮胁迫其他几个时间点无显著差异（P0.05）。氨氮胁迫6~12 h，处理组血清MDA含量无显著差异（P0.05）；氨氮胁迫24~48 h，处理组血清MDA含量显著降低（P0.05）。处理组GSH含量在氨氮胁迫过程中（6~48 h）均显著高于对照组（P0.05）。结果显示，饲喂硫辛酸在氨氮胁迫下促进大口黑鲈血清T-SOD和CAT酶活性，提高血清GSH含量，降低MDA含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.012.T003表3硫辛酸对氨氮胁迫下大口黑鲈血清抗氧化指标的时序影响项目组别胁迫时间6 h12 h24 h48 hT-SOD/(U/mL)对照组115.54±8.50a106.17±1.20b103.97±6.80b97.65±5.80a处理组121.52±7.80a114.49±4.90a122.81±6.40a100.33±5.50aCAT/(U/mL)对照组17.89±1.24a16.33±1.21a15.28±0.78a10.71±3.18a处理组18.18±0.99a16.06±0.26a15.37±2.42a17.24±3.16bMDA/(mg/L)对照组2.37±1.31a1.98±0.15a2.72±0.59b4.76±2.08b处理组1.89±0.37a1.80±0.31a1.89±0.14a1.67±0.21aGSH/(mg/L)对照组2.75±0.50a3.37±0.54a3.54±0.31a2.33±1.06a处理组5.24±1.19b4.87±0.66b5.74±0.57b4.83±0.83b2.4硫辛酸对氨氮胁迫下对大口黑鲈肝脏抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，氨氮胁迫6~12 h，处理组肝脏T-SOD酶活力无显著差异（P0.05）；氨氮胁迫24~48 h，处理组T-SOD活性显著升高（P0.05）。氨氮胁迫6、48 h，处理组CAT活力显著升高（P0.05）。氨氮胁迫48 h，处理组MDA含量显著降低（P0.05）。氨氮胁迫12~48 h，处理组GSH含量显著升高（P0.05）。结果显示，饲喂硫辛酸可增强大口黑鲈在应对氨氮胁迫时肝脏T-SOD和CAT的活性，并能够较长时间抵抗氨氮胁迫引起的氧化应激，提高肝脏抗氧化产物GSH含量，缓解由于氨氮胁迫引起的肝脏MDA含量的升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.012.T004表4硫辛酸对氨氮胁迫下大口黑鲈肝脏抗氧化指标的时序影响项目组别胁迫时间6 h12 h24 h48 hT-SOD/(U/mg prot)对照组175.44±27.31a107.81±28.23a113.67±27.91a148.99±19.83a处理组184.21±48.70a155.48±37.00a185.39±35.20b184.61±10.60bCAT/(U/mg prot)对照组27.30±3.44a34.61±4.64a33.91±7.63a26.68±6.38a处理组33.88±1.27b40.34±5.92a47.44±7.07a42.25±7.55bMDA/(μmol/g prot)对照组1.62±0.39a1.41±0.42a1.60±0.89a9.87±1.87b处理组1.38±0.06a1.18±0.35a2.29±0.97a2.73±1.69aGSH/(mg/g prot)对照组15.71±2.74a12.85±3.67a13.16±2.46a11.56±2.23a处理组16.98±5.16a19.01±4.65b18.31±3.11b19.06±1.67b3讨论正常生理情况下，生物体内的氧化系统与抗氧化防御系统处于相互制约的状态，可使机体保持动态平衡；当机体受到胁迫时，易在体内产生大量ROS，引发氧化应激[12]。为应对这种情况，机体利用自身的抗氧化酶体系如CAT、SOD和谷胱甘肽还原酶（GR）等促进ROS降解，降低其含量；还可利用从体外获得的非酶系抗氧化剂如类胡萝卜素、α-生育酚、抗坏血酸、维生素E和硫辛酸等清除ROS；二者协同作用，共同维持机体的ROS平衡。α-硫辛酸抗氧化性能较强，其分子结构中含有一个二硫键，进入细胞内部后，该二硫键即被多种酶还原，形成二氢硫辛酸。机体内α-硫辛酸和二氢硫辛酸可通过氧化-还原循环相互转换，参与有害物质的氧化还原，可帮助机体清理ROS，还可螯合金属离子以减轻其对机体造成的氧化损伤[16]，并能够参与体内常见抗氧化剂如α-生育酚、抗坏血酸和谷胱甘肽等的再循环形成[10,17]。近年来，硫辛酸作为强抗氧化剂添加剂在水生动物上的研究逐渐增多，但尚未见到关于硫辛酸增强水生动物抗氨氮胁迫的相关报道。3.1氨氮胁迫对大口黑鲈氧化应激的影响氨氮大多数时候以非离子氨（NH3）和离子铵（NH4+）形式存在于水体中，二者间可相互转换，受温度、pH值和盐度等因素影响呈动态变化，对鱼类具有很强的毒性[18-19]。关于氨氮对鱼类毒害机理研究较多。NH3毒性强，极易经由鱼鳃等器官进入机体内，诱导机体产生大量的自由基，使鱼体产生氧化应激现象[20-22]，影响鱼体的呼吸、排泄、抗氧化防御系统和生长，严重时导致死亡[23-24]。已有研究者开展了氨氮对大口黑鲈的急性和慢性毒性效应的分析，分析了大口黑鲈氨氮96 h半致死浓度[25-26]。在本研究中，参考Egnew等[15]获得的大口黑鲈氨氮96 h半致死浓度，选取了相对安全的氨氮浓度对大口黑鲈幼鱼进行氨氮急性胁迫。结果表明，大口黑鲈受到胁迫后血清和肝脏中T-SOD和CAT活性以及MDA含量均不同程度升高，而GSH含量变化不大，与在其他鱼经氨氮胁迫后抗氧化酶及相关产物变化趋势类似。经氨氮胁迫的翘嘴鳜幼鱼肝脏SOD和CAT酶活力均升高，GSH含量也有所升高[26]。采用适中浓度氨氮胁迫的黄颡鱼肝脏SOD活性和MDA含量升高[27]。说明氨氮可以引起大口黑鲈抗氧化防御体系的应答。3.2硫辛酸对氨氮胁迫下大口黑鲈抗氧化能力的影响生物体为缓解因受到环境胁迫而产生的氧化应激，往往会增强抗氧化系统内相关酶活力应对胁迫。如抗氧化酶体系的T-SOD和CAT等，均为检验生物体抗氧化状态的重要指标；T-SOD将机体在应激过程产生的有害O2-转化为H2O2，CAT可以将H2O2转化为O2和水，避免机体细胞受到H2O2的伤害[16-17]。研究表明，摄食硫辛酸可提高水产动物肝脏或血清的T-SOD及CAT等酶的活性[28-32]。Zhang等[28]报道，饵料中添加硫辛酸显著促进了皱纹盘鲍肝脏中SOD的酶活，且其体液中脂质过氧化物的含量显著降低。有研究发现，饲喂硫辛酸可以显著促进草鱼肝脏和血清中SOD酶活力，但仅提高肝脏CAT活性，对血清中CAT活性无影响[29]。有报道指出，硫辛酸可提高镉胁迫下皱纹盘鲍肝脏SOD和CAT活性[30]。硫辛酸可显著促进高脂饵料喂养的罗非鱼肝脏和血清中SOD和GSH-Px的活性[31]。本研究结果显示，氨氮胁迫导致大口黑鲈肝脏和血清中T-SOD和CAT活性升高，饲喂硫辛酸后又进一步增强了大口黑鲈肝脏和血清中两种酶活性，与上述研究结果类似，即硫辛酸可提高胁迫条件下抗氧化酶活力。但硫辛酸影响氨氮胁迫后大口黑鲈血清和肝脏T-SOD和CAT活性变化情况并不一致。氨氮胁迫12~24 h，硫辛酸显著提高了鱼体血清中T-SOD活性；胁迫24~48 h，显著提高了肝脏中T-SOD活性。原因为饲喂硫辛酸后大口黑鲈血液循环系统在应对氨氮胁迫时快于肝脏。硫辛酸逐渐提高鱼体血清中CAT活性，并在氨氮胁迫后期48 h达到显著性差异；而在氨氮胁迫6、48 h，硫辛酸显著提高鱼体肝脏中CAT酶活力，胁迫12~24 h，肝脏CAT酶活力高于对照组但未达到显著性差异。结果表明，硫辛酸可在大口黑鲈遭受胁迫时，提高机体抗氧化酶T-SOD和CAT的活性，提高机体抗氨氮胁迫能力。本研究检测了与机体氧化应激相关的MDA和GSH在大口黑鲈肝脏和血清中的含量变化情况。细胞在氧化代谢过程中最终形成分解产物MDA，在组织中含量可反映机体受到ROS攻击情况。因此，过多MDA在机体沉积对细胞会有一定程度的危害。据研究报道，饲喂硫辛酸可显著抑制丝足鲈[30]、罗非鱼[31]和皱纹盘鲍[32]肝脏或血清中由于氧化应激导致的MDA含量升高。本研究中，氨氮胁迫使大口黑鲈血清和肝脏中MDA含量随时间延长而显著增加，氨氮引起了大口黑鲈的氧化应激。摄食硫辛酸后的大口黑鲈经氨氮胁迫，其血清和肝脏中MDA含量变化并不明显，与上述研究结果一致，说明摄食硫辛酸可显著缓解氨氮胁迫导致的大口黑鲈组织中MDA水平升高。GSH是一种细胞内抗氧化剂，可帮助细胞清除ROS，维持细胞氧化还原平衡[33]。硫辛酸在抗氧化过程中的产物二氢硫辛酸可介导谷胱甘肽二硫化物（GSSG）还原为GSH[34]。摄食硫辛酸的大口黑鲈经氨氮胁迫，其血清和肝脏中GSH含量均显著高于对照组，说明大口黑鲈摄入的硫辛酸部分可转化为DHLA，导致血清和组织中GSH含量升高，与硫辛酸在其他水生动物中作用一致。Huang等[30]研究指出，金属铬胁迫下硫辛酸可提高丝足鲈肝脏GSH的含量。高脂饵料中添加适量硫辛酸也可提高罗非鱼肝脏和血清中GSH的含量[31]。综上所述，氨氮胁迫时使用硫辛酸可降低大口黑鲈肝脏和血清中MDA含量，提高GSH含量，缓解鱼体在胁迫下导致的氧化应激，增强鱼体的抗氧化能力。4结论水体中的氨氮胁迫可引起大口黑鲈的氧化应激反应。摄食硫辛酸后的大口黑鲈受到氨氮胁迫，可通过增强血清和肝脏抗氧化酶活力降低血清及肝脏中氧化应激产物的含量，增强鱼体的抗环境胁迫能力，缓解氧化应激状态。在大口黑鲈饲料中添加硫辛酸可提高其抗氧化能力，对鱼体健康具有积极作用。