甘草作为药食同源的常用植物资源，含有丰富的甘草酸、甘草多糖及黄酮类化合物，甘草酸是其中主要有效成分之一[1]。甘草及其提取物具有提高杀菌抗病毒活性、增强机体抗氧化能力、增强免疫力、调节代谢、维护消化系统及肠道屏障等生物特性[2-3]。甘草作为中药饲料添加剂直接添加在饲料中，可增加动物采食速度，改善肉质，预防疾病[4-8]。饲喂甘草可抑制奶牛瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌、总瘤胃球菌等瘤胃微生物活力，改善奶牛瘤胃参数[7]，提高饲料利用效率。此外，甘草在水产养殖中对鱼鳖的出血病、细菌病、白点病等具有很好的预防和治疗作用，有效提高其成活率[9]。中药产业产生的废弃甘草药渣中含有大量有效物质，直接加入饲料中，动物吸收利用效率低[10]。通过微生物发酵中药能够大幅度催化药渣中粗纤维的分解，提高动物对有效成分的利用效率[11]。本研究以甘草药渣为原料，以甘草酸含量变化为指标，对其发酵条件进行单因素试验及响应面试验[12-13]，探索适宜的提高甘草酸含量的发酵条件，为甘草中有效物质的充分利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂甘草产自亳州市雨航生物科技有限公司，购自怀亿堂市售甘肃产红皮甘草切片；混合益生菌冻干粉购自安徽古之滕药业有限公司，包含嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌，活菌数为3×1012 CFU/g；MRS培养基。1.2仪器设备LDZX-30FBS立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；UV-2100紫外可见分光光度计购自龙尼柯（上海）仪器有限公司；HNY-2102恒温培养振荡器购自天津市欧诺仪器仪表有限公司；AR124CN电子天平购自奥豪斯仪器（上海）有限公司。1.3试验方法1.3.1混合益生菌发酵甘草工艺流程及发酵方法工艺流程：市售甘草→分拣清洗→烘干→粉碎→混合MRS培养基→高温灭菌→取样→接种混合益生菌→控温振荡发酵→成品。清除甘草中的杂质，干燥，利用破壁机破碎成甘草粉，制备标准MRS液体培养基（ρ≈1 g/mL），按发酵混合物总质量100 g的标准，设计料液比均匀混合甘草粉及标准MRS培养基，置于高压蒸汽灭菌锅121 ℃高温灭菌20 min，充分灭菌，溶解甘草粉末中的有效物质，置于紫外环境下超净工作台静置冷却1.5 h，取1 mL上清液测量甘草酸含量，待温度降至35 ℃，接入混合益生菌冻干粉，充分混匀，接种后的发酵瓶置于37 ℃、150 r/min条件下恒温振荡培养[14]，达到试验设计的培养时长后取出发酵液并测量其甘草酸含量。1.3.2单因素试验设计定量为甘草粉末与MRS液体培养基的料液比（m甘草∶v培养基=g/mL）、混合益生菌冻干粉接种量（m冻干粉∶v培养基=g/mL）、发酵时间（h），变量为发酵前后甘草酸变化率（变化率=发酵后甘草酸含量/发酵前甘草酸含量×100%）的单因素试验[15]，考察料液比（0.050、0.125、0.200、0.275 g/mL）、接种量（0.005 0、0.017 5、0.030 0、0.042 5 g/mL）、发酵时间（8、12、16、20、24 h）对发酵前后甘草酸含量的影响。测定该混合益生菌在MRS培养基中的生长曲线，确定其进入稳定期前的发酵时间为初始发酵时间。在接种量为3 g/mL、初始发酵时间条件下，甘草药渣与培养基料液比分别为0.050、0.125、0.200、0.275 g/mL时，考察其甘草酸变化率，确定甘草酸变化率最大的为最适料液比。在最适料液比、初始发酵时间条件下，考察混合益生菌冻干粉的接种量分别为0.005 0、0.017 5、0.030 0、0.042 5 g/mL时的甘草酸变化率，确定甘草酸变化率最大的为最适接种量。在最适料液比、最适接种量的条件下，考察发酵时间分别为8、12、16、20、24 h时的甘草酸变化率，确定最适发酵时间。通过最适料液比、最适接种量、最适发酵时间确定最佳试验范围。1.3.3响应面法优化混合益生菌发酵甘草根据单因素试验得到的最佳试验范围，选取料液比（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为自变量，以甘草酸变化率（R：发酵后甘草酸含量/发酵前的甘草酸含量×100%）为考察因素，以Box-Behnken方法为设计原理，设计3因素3水平的响应面试验[16]，对混合益生菌发酵甘草的工艺方法进行优化。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.T001表1响应面试验因素水平因素水平A料液比/(g/mL)B接种量/(g/mL)C发酵时间/h-10.0500.005 01200.1250.017 51610.2000.030 0201.3.4甘草酸检测方法甘草酸的最大吸收峰于252 nm处，采取紫外分光光度法在最大吸收峰处测定吸光度，取1 mL待测发酵液使用50%乙醇溶液稀释100倍，摇匀，使用石英比色皿在252 nm下测量吸光度[17]，记录其吸光度，根据标准曲线计算其含量。1.3.5甘草酸铵标准曲线的绘制配制标准对照品溶液：在10 mL容量瓶中加入精确称取的5.6 mg甘草酸铵标准品，加入50 %乙醇溶液稀释至10 mL刻度处摇匀。准确量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL标准对照品溶液于10 mL具塞试管中，加入50%乙醇溶液至刻度，摇匀，使用紫外分光光度计在252 nm波长下分别吸光度值。以甘草酸铵浓度（mg/L）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制甘草酸铵标准曲线，得出线性回归方程。1.4数据统计与分析试验数据利用Excel进行处理，计算发酵后甘草酸含量的变化率，将变化率代入Design-Expert 12中利用Box-Behnken原理[18]设计的响应面试验设计的变化率（R），对试验的回归函数进行显著性分析、方差分析、图像处理及最佳发酵条件[19]。2结果与分析2.1甘草酸铵标准曲线（见图1）由图1可知，甘草酸铵的线性回归方程为y=0.009 2x+0.020 4，相关系数R2=0.962 1，表明在浓度5.6~33.6 mg/L范围内呈现良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F001图1甘草酸铵标准曲线2.2单因素试验混合益生菌生长曲线见图2。由图2可知，混合益生菌在MRS液体培养液中，20 h左右进入生长稳定期，16 h为初始发酵时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F002图2混合益生菌生长曲线2.2.1甘草粉与培养基的料液比对甘草酸含量的影响（见图3）由图3可知，在其他条件相同时，甘草酸变化率在料液比为0.050~0.200 g/mL内呈现增加趋势，在0.200~0.275 g/mL内呈现下降趋势。因此，0.150为最适料液比，选择甘草粉与培养基的料液比为0.050、0.125、0.200 g/mL进行后续响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F003图3甘草粉与培养基的料液比对甘草酸含量的影响2.2.2混合益生菌接种量对甘草酸含量的影响（见图4）由图4可知，在其他条件相同时，在0.005~0.030 g/mL时，变化率随接种量增加而增加，在0.030 g/mL后接种量增加变化率随之减少。因此，0.030 g/mL为最适接种量，选择接种量为0.005 0、0.017 5、0.030 0 g/mL进行后续的响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F004图4混合益生菌接种量对甘草酸含量的影响2.2.3发酵时间对甘草酸含量的影响（见图5）由图5可知，随着发酵时间的增加，甘草酸变化率逐渐增加，在发酵时间12~20 h时，甘草酸变化率最大，在20 h后甘草酸变化率降低。因此，20 h为最佳发酵时间，选择发酵时间为12、16、20 h进行后续响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F005图5发酵时间对甘草酸含量的影响2.3响应面优化试验选用料液比（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为自变量，甘草酸变化率（R）为因变量，以Box-Behnken设计原理设计混合益生菌发酵甘草对甘草酸含量影响的响应面试验。响应面试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.T002表2响应面试验结果序号A料液比/(g/mL)B接种量/(g/mL)C时间/h甘草酸变化率/%1-1-1010721-101113-11010341101095-10-1107610-11107-101103810111190-1-11071001-1105110-111071201110713000117140001141500011316000116170001202.3.1回归方程及方差分析对试验得到的甘草酸变化率进行响应面数据分析，回归模拟方程为：R=116+2.62A-B-0.125C+0.5AB+1.25AC+0.5BC-3.62A2-4.87B2-4.63C2。响应面试验方差分析结果见表3。由表3可知，响应面试验结果拟合得到的回归方程模型P0.05，模型显著；失拟项P0.10，表现为不显著，说明回归方程模型与实际结果差异较小。在模型中，A、A2对甘草酸含量变化具有显著作用，B2、C2对甘草酸含量变化具有极显著，作用。根据F值可以推断各因素对响应值的影响依次为：ABC，即料液比接种量发酵时间。决定系数R2=0.907 4，说明模型拟合程度较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.T003表3方差分析表项目平方和自由度均方F值P值显著性Model345.220938.3607.620 00.007 0**A55.120155.12010.950 00.013 0*B8.00018.0001.590 00.247 9C0.12510.1250.024 80.879 3AB1.00011.0000.198 60.669 3AC6.25016.2501.240 00.302 0BC1.00011.0000.198 60.669 3A²55.330155.33010.990 00.012 9*B²100.0701100.07019.870 00.002 9**C²90.070190.07017.890 00.003 9**残差35.25075.040失拟5.25031.7500.233 30.869 1误差30.00047.500总和380.47016R2=0.907 4注：*表示影响显著（P0.05），**表示影响极显著（P0.01）。2.3.2响应面结果分析及优化各因素交互作用对发酵过程中甘草酸含量影响的响应面及等高线图见图6。图6各因素交互作用对甘草酸含量影响的响应面及等高线图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F6a1（a）料液比与接种量的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F6a2（b）料液比与发酵时间的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.016.F6a3（c）接种量与发酵时间的交互作用由图6可知，料液比与接种量、接种量与发酵时间、料液比与发酵时间之间均对混合益生菌发酵甘草药渣中甘草酸存在一定的交互作用，但是影响不显著。最佳预测点在试验范围内，该模型的拟合度较高，可确定最优发酵工艺。2.3.3最佳发酵工艺确定利用Design-Expert 12软件预测混合益生菌发酵甘草药渣提高甘草酸含量的最佳发酵工艺条件为：料液比0.195 g/mL、接种量0.029 1 g/mL、发酵时间19.57 h。此条件下，甘草酸相对含量提升最高，为110.379%。结合实际操作，最终确定验证试验的工艺条件为：料液比0.195 g/mL、接种量0.029 g/mL、发酵时间19.6 h。该条件下进行3组平行试验，测得发酵后相对发酵前甘草酸含量为111%，与理论值比较接近。结果表明，该模型可靠性高，可较为准确地反映混合益生菌发酵甘草药渣的甘草酸含量变化。3讨论利用微生物发酵[20-25]中药是中药研发的新途径，可拓展中药在食品、保健品行业、畜牧业等更多领域的应用范围。本研究采用混合益生菌发酵甘草药渣对甘草酸含量影响的试验中，证明益生菌能够提高甘草酸含量，但对其机理并未进一步验证；发酵温度、培养基起始pH值均取最适值，培养基配方是益生菌通用的MRS培养基，对温度、起始pH值、培养基配方中无机盐种类、无机盐的添加比例等对发酵试验的影响未进行探究。甘草中其他有效物质如黄酮类化合物、多糖类化合物的含量的变化未在本试验的探讨范围内。杨小芝等[26]指出，感官品质方面，确定乳酸菌添加量为1%、甘草溶液4%、发酵温度42 ℃、发酵8 h时变为酸味，甘草腥味消失，感官方面为甘草发酵提供了新方向。向宇[27]研究确定以甘草药渣为主要成分纤维素的黑曲霉、地衣芽孢杆菌组合菌培养基，以黄酮析出量、酸性蛋白酶活及纤维素酶活为指标，确定混合菌接种量6%、黑曲霉∶地衣芽孢杆菌接种比2∶1、固体培养基含水量70%、发酵时间7 d的发酵方案。关于甘草发酵的其他文献中，接种量、料液比、发酵时间、温度、起始pH值等均存在区别。后续探究中，期望对甘草发酵进行全面研究，降低发酵成本，提高甘草中甘草酸、黄酮化合物及其他有效成分的充分利用率。4结论通过单因素试验和Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 12软件响应面设计优化混合益生菌发酵甘草药渣提高其甘草酸含量的工艺条件，对甘草药渣与培养液的料液比、混合益生菌冻干粉接种量、发酵时间进行综合考察，得到最终发酵工艺为：料液比0.195 g/mL、接种量0.029 g/mL、发酵时间19.6 h。该条件下发酵后甘草酸含量提高111%，接近预测值，验证了试验模型的可靠性，为高效利用甘草及药渣提供参考。