随着我国畜牧业的不断发展，优质粗饲料资源短缺，高效利用饲料原料、开发新的饲料资源迫在眉睫。我国是食用菌生产大国，2019年食用菌生产总量为3.96×108 t[1]。每100 g基质料生产鲜菇可产生60 g菌渣，每年约产生2.37×108 t菌渣[1-2]。目前，食用菌菌渣的处理方法主要是丢弃或焚烧，会造成资源浪费、污染环境[3]。菌渣来源广泛，富含粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、微量元素、氨基酸及其他营养成分[4]。菌渣具有特定香味，颗粒小或呈粉末状，适口性、可消化性较好，可直接或加工后饲喂畜禽，是潜在的饲料资源[3]。但菌渣也含有一些有害物质，如霉菌毒素、单宁等，直接饲喂动物可能会阻碍动物的生长发育，降低生产性能[5]。吕文婷等[6]研究发现，在AA肉鸡配合饲料中添加少量平菇菌糠可提高日增重，降低料重比，提高经济效益。张书良等[7]研究发现，在肉鹅饲料中添加不同比例的杏鲍菇菌渣可提高肉鹅日增重和经济效益。郭万正等[8]在波尔山羊基础日粮中添加发酵金针菇菌糠，结果显示，各组生长性能无显著差异，生理生化指标均无显著差异。固态发酵指在固态基质中的微生物发酵，发酵基质中几乎没有可以自由流动的水[9]。固态发酵具有可保持微生物原始的生长状态、利于发酵代谢产物的积累与多样性、培养基质含水量低、不需要液态发酵的废水处理、环境友好、生产成本低等优点[10]。枯草芽孢杆菌的芽孢营养体易保存，可作为微生物饲料的发酵菌种[10-12]。枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中能够分泌大量抗菌肽、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性物质，能够促进畜禽营养吸收转化率，增强机体免疫力，可利用枯草芽孢杆菌的发酵特性提升饲料的消化利用率。本试验采用枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌渣的固态发酵方法优化发酵条件，旨在获得适口性较好的微生物饲料。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种复壮枯草芽孢杆菌菌种由江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院益生菌研究组提供。将冷冻的枯草芽孢杆菌种接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，恒温振荡培养，传代3次复壮，4 ℃保存，枯草芽孢杆菌菌液活菌数量为1×107 CFU/mL。1.1.2菌渣新鲜金针菇菌渣由南京金万辰生物科技有限公司提供，金针菇生产培养基质原料组成见表1。鲜金针菇菌渣主要化学成分及有关指标见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T001表1金针菇生产培养基质原料组成Tab.1Substrate composition of Flammulina velutipes production culture medium项目含量合计100.0玉米芯39.4细米糠30.0麸皮7.0玉米粉4.8棉籽壳5.0啤酒糟（新鲜）5.0大豆皮5.0石灰1.9石膏1.9%XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T002表2鲜金针菇菌渣主要化学成分及相关指标Tab.2Proportion of chemical composition and related indexes in fresh Flammulina velutipes residue项目含量水分/%55.20粗蛋白质/%7.20粗脂肪/%1.90酸性洗涤木质素/%10.90酸性洗涤纤维/%40.30中性洗涤纤维/%63.80粗灰分/%10.80有机质/%77.80pH值6.14容重/(g/cm³)0.141.1.3培养基液体培养基：牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、蒸馏水1 000 mL，加热搅拌，校正pH值至7.2~7.4，121.3 ℃高压灭菌30 min，倒入锥形瓶，冷却，4 ℃保存。固体培养基：牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉25 g、蒸馏水1 000 mL，加热搅拌，校正pH值至7.2~7.4；121.3 ℃高压灭菌30 min，倒入玻璃培养皿，冷却凝固后倒置，4 ℃保存。1.2试验方法1.2.1单因素试验探究枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌渣的接种比例、发酵时间、发酵温度等影响因素。将发酵产物稀释至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37 ℃培养24 h，测定枯草芽孢杆菌活菌数量，探究各因素的最适条件范围。1.2.1.1菌渣发酵的最佳接种比例试验分两次进行，探究枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌渣的水分需求以及菌种接种比例。第1次试验，无菌玻璃培养皿编号1~6，分别加入0、2、4、6、8、10 mL蒸馏水，各加2 mL枯草芽孢杆菌液和10 g金针菇菌渣，混匀，37 ℃培养24 h，观察发霉情况。第2次试验，无菌玻璃培养皿编号0~6，分别加入0、1、2、3、4、5、6 mL枯草芽孢杆菌液和10 g金针菇菌渣，混匀，37 ℃培养24 h，观察发霉情况。1.2.1.2菌渣发酵的最佳温度采用不同温度（31、34、37、40 ℃），发酵时间24 h，枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣接种比例为5︰10 mL/g，菌渣混合液初始pH值为7.0，每组5个重复。将发酵产物稀释至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37 ℃培养24 h，观察发霉情况并测定枯草芽孢杆菌数量。1.2.1.3菌渣发酵的最适时间试验分两次进行。第1次试验绘制枯草芽孢杆菌在菌渣中的生长曲线，初步了解培养时间。枯草芽孢杆菌液与菌渣的接种比例为5︰10 mL/g，菌渣混合物初始pH值为7.0，温度34 ℃，分别培养0、4、8、12、16、20、24、28、32 h；采取不同时间点的发酵产物稀释至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37 ℃培养24 h，测定枯草芽孢杆菌数量。第2次试验根据第1次试验的结果明确培养时间。采用不同培养时间（16、20、24、28 h），温度34 ℃，枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣接种比例为5︰10 mL/g，菌渣混合液初始pH值为7.0，每组5个重复；发酵产物稀释至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，37 ℃培养24 h，测定枯草芽孢杆菌数量。1.2.2正交试验根据单因素试验结果，通过L9（33）正交试验和曲线回归分析确定接种比例、发酵温度、发酵时间对发酵效果的影响程度及最适发酵条件。正交试验因素水平见表3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T003表3L9（34）正交试验因素水平设计Tab.3L9(34) orthogonal test factor level design水平A发酵时间/hB发酵温度/℃C接种比例/(mL/g)120344︰10222355︰10324366︰101.3数据统计与分析采用Excel 2016软件对试验数据进行处理，绘制不同发酵时间细菌生长分布图，采用SPSS软件进行多因素方差分析和二次曲线回归分析。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1接种比例的确定第1次试验加入蒸馏水菌渣培养后，均有较多霉菌长出，不加蒸馏水的培养后霉菌较少或未见；第2次试验不加蒸馏水，不同接种比例的培养结果见表4。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T004表4不同接种比例的培养结果Tab.4Cultural results influenced by different inoculated proportion组别金针菇菌渣/g芽孢杆菌液/mL结果0100长满霉菌11015个以上霉菌21023~5个霉菌点31031~2个霉菌点4104无霉菌5105无霉菌6106无霉菌根据两次试验结果分析，初步推断，金针菇菌渣发酵的枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣比例为4∶10~6∶10 mL/g时，发酵效果较好。2.1.2发酵温度的确定（见图1）由图1可知，枯草芽孢杆菌液与菌渣的接种比例为5∶10 mL/g，菌渣混合物于初始pH值为7.0，发酵时间24 h条件下，34、37 ℃细菌生长情况优于31、40 ℃，4种发酵温度下均未见发霉现象，初步确定发酵最适温度范围为34~37 ℃。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F001图1不同发酵温度的细菌数量Fig.1Number of bacteria colonized under different fermented temperature2.1.3发酵时间（见图2、图3）由图2可知，枯草芽孢杆菌培养4 h后进入对数生长期，16 h后生长速度减慢，16~24 h为稳定期，24 h后进入衰退期。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F002图2菌渣中不同时间枯草芽孢杆菌生长曲线Fig.2Growth curve of Bacillus subtilis in different duration points由图3可知，20、24 h的细菌生长情况优于16、28 h，故确定发酵时间范围为20~24 h。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F003图3不同发酵时间的细菌数量Fig.3Number of bacteria colonized in different fermented duration通过单因素试验，初步确定菌渣发酵的枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣的最佳比例为4︰10~6︰10 mL/g，最适发酵温度为34~37 ℃，最适发酵时间为20~24 h。2.2正交试验结果（见表5、表6）由表5可知，接种比例对固态发酵中枯草芽孢杆菌的活菌数量影响最大，其次是发酵时间，发酵温度影响最小。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T005表5正交试验结果Tab.5Results of orthogonal test试验A发酵时间/hB发酵温度/℃C接种比例/(mL/g)活菌量/(lg CFU/g)120344∶108.45220356∶108.74320365∶108.70422346∶108.88522355∶108.79622364∶108.58724345∶108.84824354∶108.66924366∶108.94K125.8926.1725.69K226.2526.1926.56K326.4426.2226.33R0.550.050.87由表6可知，发酵时间、发酵温度、接种比例为活菌量的99.4%变化原因，其中，接种比例对活菌量有极显著影响（P0.01），发酵时间对活菌量有显著影响（P0.05），发酵温度对活菌量不显著。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.T006表6正交试验方差分析Tab.6Analysis of variance of orthogonal test变异来源平方和自由度均方F值P值截距686.0911686.0911 187 465.6920**A发酵时间0.05220.02646.0190.022*B发酵温度0200.3970.752C接种比例0.13520.068117.2970.008**误差0.00120.001R²=0.994各因子对发酵效果影响程度：接种比例发酵时间一定范围内的发酵温度，与极差分析结果一致。2.3最适条件曲线回归分析（见图4~图6）由图4可知，发酵时间为24 h时，枯草芽孢杆菌活菌量最多，效果最佳。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F004图4发酵时间与活菌量的拟合曲线Fig.4Fitting curve on fermented duration and number of live bacteria由图5可知，在一定范围内，发酵温度对发酵效果无明显影响。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F005图5发酵温度与活菌量的拟合曲线Fig.5Fitting curve on fermented temperature and number of live bacteria由图6可知，枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣的比例为6∶10 mL/g时效果最佳。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F006图6接种比例与活菌量的拟合曲线Fig.6Fitting curve on inoculated proportion and number of live bacteria确定最适发酵条件为发酵时间24 h、发酵温度34 ℃、枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣的比例为6∶10 mL/g。2.4最适发酵条件的验证（见图7、图8）由图7可知，最适发酵条件下，发酵产物稀释至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，37 ℃培养24 h，发酵后细菌生长良好，分布均匀，菌落大小正常，无霉菌生长。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F007图7枯草芽孢杆菌菌落生长情况Fig.7Colony growth of Bacillus subtilis由图8可知，经革兰氏染色无杂菌污染。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F008图8枯草芽孢杆菌镜检Fig.8Microscopic test on Bacillus subtilis2.5发酵产物活菌数量和卫生指标的测定在最适发酵条件下，测得发酵菌渣产物中活菌数量为7.5×108 CFU/g，符合发酵饲料生产技术规程的要求（TQBAA 001—2009）[12]。有毒有害物质黄曲霉毒素B1的含量0.15 μg/kg，符合国家饲料卫生标准的要求（GB 13078—2017）[13]。3讨论3.1细菌生长营养需求新鲜金针菇菌渣水分含量为55.26%，枯草芽孢杆菌菌液与菌渣比例为6∶10 mL/g的混合物水分含量为64.33%，发酵产物水分含量为64.13%，表明枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌渣的水分含量充足。菌渣自身的麸皮、玉米、细米糠、棉籽壳、菌丝体等富含碳源和氮源，能够满足枯草芽孢杆菌生长需求。菌渣菌液混合物的初始pH值约为7.0，不需再做调整，更接近生产实际，适合规模化生产。3.2固态发酵与条件细菌生长的主要影响因素为培养基营养、水分含量、初始pH值、外界温度及培养时间。本研究采用益生菌于无游离水基质上的固态发酵方式，发酵中产生的热量可促进水分蒸发，利于保持发酵产物的低水分含量[14]，也可减少水分含量高引起发霉的现象，方便后期烘干贮藏和直接饲喂或与其他饲料混合。不同接种菌液的比例导致固态发酵中水分含量不同，对枯草芽孢杆菌的生长结果具有一定影响。枯草芽孢杆菌液与金针菇菌渣的接种比例为6∶10 mL/g时，发酵效果较好，霉菌生长受到抑制；降低接种比例时，杆菌生长较好但无法有效抑制霉菌生长。培养时间可影响细菌生长。枯草芽孢杆菌在液态培养基中适应期约为6 h，且固态发酵中水分和营养成分均低于液态培养基。本研究中金针菇菌渣发酵的适应期延长，培养4 h后进入对数生长期；随着菌渣中营养被利用，培养至22 h时，生长速度进入稳定期，24 h后细菌数量不再上升。培养温度液可影响细菌生长，一般细菌适宜生长温度为37 ℃。菌渣固态发酵时，可产生一定的热量；枯草芽孢杆菌抗逆性强，发酵温度为34 ℃时，繁殖速度及数量与37 ℃无显著差异，与文献报道一致[15]。4结论枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌渣最适发酵条件为发酵温度34 ℃、发酵时间24 h、枯草芽孢杆菌菌液与金针菇菌渣接种比例为6∶10 mL/g，活菌数符合发酵饲料生产技术规程要求，黄曲霉毒素含量符合饲料卫生标准要求。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.001.F009