犬肠道中微生物总量约为1014个,能够形成复杂的微生物群落[1]。犬肠道菌群间、菌群与其接触环境间会相互作用,使肠道微生态系统处于相对平衡状态。肠道菌群维持平衡状态,有利于营养物质的消化和吸收,保持正常的生理功能,抵抗病原微生物入侵,提升机体免疫防御等作用。当幼犬受到自身生理因素、营养因子缺乏、环境应激、饲养管理不当和病原微生物感染时,会破坏肠道菌群稳定,引起幼犬腹泻,影响幼犬生长发育。抗生素可以减少幼犬腹泻,但使用抗生素容易导致药物残留和细菌耐药性。因此,饲用抗生素替代品的开发已成为养殖行业研究的热点。中草药饲料添加剂具有不易产生耐药性、有效抑制有害菌、激活抗菌因子、提高机体免疫力的优势[2]。目前,中草药在家畜和家禽上应用较多,在犬中的应用研究尚不多见,尤其对犬肠道菌群数量影响的研究未见报道。因此,本试验以幼犬全价粮为底物,添加一定量的中草药,采用16S rRNA基因高通量测序技术,检测马里努阿犬幼犬粪便中菌群结构,分析不同剂量的中草药添加剂对马里努阿犬幼犬粪便菌群指标的影响,以期为中草药添加剂在防治幼犬腹泻和促进生长发育的应用中提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取30头体况健康良好、出生日期相近(3~4月龄)、体重相近的马里努阿犬为试验对象。本试验采用完全随机设计,按照体重相近、公母各半的原则将30只幼犬随机分为3组,每组5个重复,每个重复2只犬。对照组幼犬饲喂基础日粮(康多乐幼犬全价犬粮),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别在基础日粮中添加0.2和0.4 g/kg复方中草药添加剂。1.2试验时间和地点2021年5月10日—2021年6月14日在公安部沈阳警犬基地进行试验,共35 d。预试期7 d,正式试验期28 d。1.3复方中草药添加剂的制备原料组成:苍术18%、黄连8%、藿香11%、滑石9%、黄芪9%、木香6%、山楂6%、甘草2%、松针粉31%等。添加剂制备:将上述原料按一定的比例称重,粉碎,过筛(100目),混匀,制成散剂,质检,分装。1.4样品采集试验采集新鲜粪便,共计30个粪样。每个粪样混合均匀,分装于EP管中,干冰速冻,置于-80 ℃保存,用于测定粪便菌群多样性。1.5测定指标及方法采用Qiagen DNA提取试剂盒提取幼犬粪便总DNA,提取方法严格按照试剂盒说明书的步骤进行。提取总DNA,纯化,检测浓度和纯度,以纯化的粪便总DNA作为模板,利用设计好的引物对细菌的16S rRNA V3~V4区进行PCR扩增,所用上游引物为341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'),下游引物为805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')。PCR扩增体系(20 μL):5×FastPfu Buffer(4 μL)、2.5 mmol/L dNTPs(2 μL)、5 μmol/L上下游引物(各1.0 μL)、FastPfu Polymerase(0.4 μL)、DNA模板10 ng、补充ddH2O至20 μL。PCR反应条件为:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共27个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收,进行高通量测序。对测得的序列进行质控过滤,在97%的相似水平下进行操作分类单元(OTU)聚类和生物信息统计分析;基于OTU聚类分析结果,进行Alpha多样性指数分析;基于分类学信息,在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。1.6数据统计与分析数据采用Excel初步整理,SPSS 17.0软件中单因素方差分析方法(One-way ANOVA)进行统计分析。结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1测序数据分析30份马里努阿犬粪便样本(每组各10份)细菌DNA高通量测序,得到高质量序列数为1 200 474条,序列平均长度为451.478 bp,其中最小样本的序列数为1 323 bp。按照97%的相似度聚类,所有序列归属为17个门(Phylum),32个纲(Class),56个目(Order),99个科(Family),179个属(Genus),437个OTU。2.2粪便菌群Alpha多样性指数分析(见表1)根据OTU聚类分析结果,对马里努阿犬粪便菌群进行Alpha多样性分析,主要指标包括粪便样本的微生物群落的覆盖率(Coverage)、丰富度(Ace和Chao)和多样性(Shannon和Simpson)指数。Shannon值越大,表明粪便菌群多样性越高;Simpson值越大,表明粪便菌群多样性越低;Ace和Chao值越大,表示样本含有的OTU数目越多,粪便菌群的丰富度越高。由表1可知,各组马里努阿犬粪便菌群测序Coverage均在0.99以上;试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便菌群Simpson指数显著高于对照组(P0.05),但试验Ⅰ组和验Ⅱ组差异不显著(P0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便菌群Shannon指数显著低于对照组(P0.05),但试验Ⅰ组和试验Ⅱ组差异不显著(P0.05),对照组马里努阿犬粪便菌群的多样性显著高于试验组(P0.05),试验Ⅰ组犬粪便菌群的多样性虽然高于试验Ⅱ组,但差异不显著(P0.05)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便菌群Ace和Chao指数都显著高于对照组(P0.05),试验Ⅰ组与试验Ⅱ组差异不显著(P0.05),表明试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便菌群的丰富度比对照组高(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.018.T001表1粪便菌群Alpha多样性指数分析项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组Shannon指数2.71±0.39a1.87±0.25b1.74±0.09bSimpson指数0.14±0.05b0.31±0.09a0.40±0.03aAce指数254.03±23.85b282.01±29.32a292.41±20.14aChao指数241.84±16.12b279.15±25.69a286.83±20.55aCoverage0.998 90.998 90.998 9注:同行数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P0.05);下表同。2.3粪便菌群物种组成分析2.3.1Venn图分析结果(见图1)由图1可知,试验组和对照组马里努阿犬粪便菌群共有185个OTU数目。试验Ⅰ组与对照组马里努阿犬粪便样本共有209个OTU,其中试验Ⅰ组特有的OTU有101个,对照组特有的OTU有118个;试验Ⅱ组与对照组马里努阿犬粪便样本共有221个OTU,其中试验Ⅱ组特有的OTU有106个,对照组特有的OTU有106个;试验Ⅰ组与试验Ⅱ组马里努阿犬粪便样本共有282个OTU,其中试验Ⅰ组特有的OTU有28个,试验Ⅱ组特有的OTU有45个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.018.F001图1Venn图分析结果2.3.2复方中药添加剂对肠道菌群结构的影响2.3.2.1门水平粪便优势菌群分析(见表2)对照组马里努阿犬粪便菌群相对丰度大于1%的共检测出5个菌门,分别是厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。对照组中厚壁菌门是优势菌门,约占总细菌数量的65.30%。试验Ⅰ组马里努阿犬粪便菌群相对丰度大于1%的共检测出4个菌门,分别是梭杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门,试验Ⅰ组梭杆菌门是优势菌门,约占总细菌数量的52.91%。试验Ⅱ组马里努阿犬粪便菌群相对丰度大于1%的共检测出4个菌门,分别是梭杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门,试验Ⅱ组中梭杆菌门是优势菌门,约占总细菌数量的66.78%。由表2可知,与对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便中梭杆菌门和变形菌门的相对丰度显著增加(P0.05);厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门的相对丰度显著减少(P0.05)。与试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组马里努阿犬粪便中梭杆菌门的相对丰度显著增加(P0.05),厚壁菌门的相对丰度显著减少(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.018.T002表2门水平粪便优势菌群分析项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组梭杆菌门22.14±11.46c52.91±9.31b66.78±2.13a厚壁菌门65.30±18.10a35.15±8.61b21.17±1.79c变形菌门2.91±2.05b7.31±0.80a6.53±1.09a拟杆菌门7.39±4.92a3.16±1.39b4.17±0.87b放线菌门2.17±1.13a0.88±0.12b0.81±0.11b%2.3.2.2属水平粪便菌群组成(见表3)由表3可知,除去未知菌属和其他菌属,马里努阿犬粪便菌群相对丰度超过1%的菌属数量分别为:对照组15个、试验Ⅰ组5个、试验Ⅱ组6个。与对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便中梭形杆菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和副萨特氏菌(Parasutterella)显著增加(P0.05);异杆菌属(Allobaculum)、布劳特氏菌属(Blautia)、毛螺旋菌科未分类的属(unclassified Lachnospiraceae)、XIVa梭菌属(Clostridium XlVa)、XI梭菌属(Clostridium XI)、瘤胃球菌科未分类的属(unclassified Ruminococcaceae)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、大肠埃希菌-志贺菌属(Escherichia Shigella)、柯林斯氏菌(Collinsella)、拟杆菌属(Bacteroides)和粪便杆菌属(Faecalibacterium)显著减少(P0.05)。与试验Ⅱ组相比,试验Ⅰ组马里努阿犬粪便中乳酸杆菌属显著增加(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.018.T003表3属水平粪便菌群组成项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组梭形杆菌属21.75±11.58b53.79±8.46a65.48±2.18a乳酸杆菌属9.15±5.38c30.95±6.94a16.46±1.45b异杆菌属14.05±8.10a1.80±0.83b1.64±0.44b布劳特氏菌属12.42±7.97a0.28±0.12b0.36±0.10bXIVa梭菌属7.87±3.18a0.03±0.01b0.04±0.01bXI梭菌属7.56±3.04a0.14±0.08b0.58±0.16b毛螺旋菌科未分类的属5.00±3.09a0.19±0.04b0.16±0.06b紫单胞菌科未分类的属3.58±2.071.95±0.592.70±0.68瘤胃球菌科未分类的属2.64±1.61a0.23±0.06b0.24±0.08b霍尔德曼氏菌属1.98±0.87a0.00±0.00b0.01±0.00b大肠埃希菌-志贺菌属1.87±0.69a0.01±0.00b0.34±0.05b普雷沃菌属1.13±0.750.63±0.431.01±0.22柯林斯氏菌1.22±0.56a0.05±0.01b0.08±0.01b拟杆菌属1.11±0.75a0.32±0.18b0.31±0.11b粪便杆菌属1.06±0.63a0.15±0.05b0.21±0.09b副萨特氏菌0.75±0.45b6.77±0.83a5.52±0.92a其他7.97±3.16b3.71±0.56a3.87±0.17a%3讨论3.1复方中草药添加剂的成分和作用机制中草药饲料添加剂具有毒副作用小、无抗药性、无药物残留以及无污染等特点[3]。中草药作用方式特殊,被动物机体吸收后,可转化为具有显著抗病毒抑菌作用的物质,或刺激机体产生灭菌的物质[4]。研究表明,中草药添加剂对病原微生物的特异性不强,但作用面广。因此,中草药在预防动物疾病方面主要体现在提高机体非特异性免疫能力和机体自身的抗病能力[5]。苍术能够调节胃肠运动,对应激性溃疡具有较强抑制,增强胃肠黏膜防御因子,有效降低细菌耐药性的产生[6]。黄连具有泻火解毒的功效,具有抑菌及抗病毒、抗原虫作用,可用于呕吐、腹泻、腹痛的治疗[7]。藿香具有化湿和胃、止泻功能,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等均具有抑制作用[8]。滑石中的硅酸镁具有吸附和收敛作用,内服能够保护肠壁,具有清热解暑、利尿止泻、杀菌消炎作用[9]。黄芪可以补气固表、利尿排毒,对痢疾杆菌、金黄色葡糖球菌等有抑制作用,还可增加肠黏膜的吸收功能,促进营养物质的消化吸收[10]。木香具有抗菌和抗炎作用,可以抑制链球菌、金黄色葡萄球菌及白色葡萄球菌的生长[11]。山楂含有枸橼酸、苹果酸、抗坏血酸等,能够促进胃肠消化吸收,具有消食健胃、活血化瘀、收敛止痢的功效[12]。松针中不仅含有丰富的营养物质,而且有黄酮、激素、萜类化合物等生物活性物质,可促进生物体新陈代谢,具有抗酸、抗消化性胃溃疡病作用[13]。上述药物按一定比例科学加工配制,养胃健胃,迅速止泻,消除胃肠道内的致炎因子,抑制炎症发展,加速胃肠道受损部位的修复。3.2复方中草药添加剂对幼犬粪便菌群结构和数量的影响肠道微生物菌群与动物健康息息相关。当正常的肠道菌群生态系统受到各种应激因素的破坏时,条件致病菌(如大肠杆菌)的数量增加,从而影响动物的生长性能。粪便中的微生物数量在一定程度上反映动物胃肠道内部环境的变化。因此,粪便中的菌群数量可以检测动物胃肠道菌群数量的变化[14]。肠道环境中的微生物超过98%是不可培养的。确定主要病原体的存在可以通过传统的分离培养技术,但无法全面真实地反映肠道环境中微生物群落的整体状况。微生物学已经从一个以病原体为中心的研究转变为对整个微生物群落的研究。为了克服传统培养技术的缺点,全面评估肠道微生物群落,高通量测序技术已经开启了研究细菌微生物群落组成的新方法。使用高通测序技术研究中草药添加剂对动物粪便菌群影响的研究已经取得了一定的成果。王芳芳等[15]研究表明,由椿皮、金银花、黄芩和白芍等加工而成的中草药饲料添加剂,按照一定的比例添加在断奶仔猪饲料中,显著抑制了仔猪肠道内有害菌群的繁殖,大肠杆菌数量显著降低,增加仔猪肠道内有益菌种的繁殖,乳酸菌数量显著增加,仔猪的腹泻率显著降低。贺永康[16]研究表明,在肉鸡日粮中添加1.5%的中草药添加剂,能够促进盲肠双歧杆菌和乳酸杆菌的增值,抑制大肠杆菌的增值,降低肠道pH值,使十二指肠绒毛上皮结构完整,层次清晰,显著改善肠道结构。孙港[17]研究表明,日粮中添加0.1%及0.2%中草药添加剂能够对断奶仔猪和育肥猪粪便微生物多样性产生显著影响,并能够影响粪便的微生物区系。陈畅[18]研究表明,由藿香、厚朴、紫苏、白芷等加工而成的中草药饲料添加剂,按照一定的比例添加在断奶仔猪饲料中,能够显著降低14、28 d粪便中大肠杆菌的数量,增加28 d粪便中双歧杆菌的数量,极显著的提高28 d粪便中乳酸杆菌的数量。本试验结果表明,日粮中添加复方中草药添加剂具有促进肠道菌群改变和增加肠道物种丰富度的作用。通过复方中药添加剂对肠道菌群结构试验研究,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便中梭杆菌门和变形菌门的相对丰度显著增加,肠道中梭杆菌门与厚壁菌门的比例发生改变,会影响营养物质的吸收能力,证明中草药添加剂能够调控肠道的微生物群落,利于促进蛋白质的吸收,维持幼犬的肠道屏障[19]。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组马里努阿犬粪便中梭形杆菌属和乳酸杆菌属显著提高,大肠埃希菌-志贺菌属显著降低,利于营养吸收。未被胃肠道酶消化的蛋白质转运到结肠,在结肠末端被肠道菌群降解,为细菌提供氮源,梭杆菌属是参与降解蛋白质的主要细菌之一。乳酸菌可以利用饲料中的营养物质进行繁殖与代谢,乳酸菌进入动物肠道后,能够与大肠杆菌等有害菌竞争肠道上皮的黏附位点,争夺营养物质,而乳酸等有机酸能够降低肠道内pH值,增加有益菌数量,抑制有害菌的生长,有益于肠道内微生物区系的平衡和肠道健康的改善[20]。大肠埃希菌-志贺菌属为肠道内致病菌,添加复合中草药添加剂后能显著降低埃希菌-志贺菌属的相对丰度,有利营养的吸收,保障犬的健康。董汉琦[21]研究表明,在犬粮中添加陈皮的剂量(0.6 g/kg体重)时,显著增加了犬肠道乳杆菌属、瘤胃菌属相对丰度,引起机体肠道微生物多样性改变及丰度增加。舒迎霜等[22]试验表明,在基础日粮中添加黄芪多糖可使犬盲肠菌群数量增加,多样性上升,增加有益菌群所占比例,降低条件致病菌比例。以上试验结果与本试验结果一致,表明中草药添加剂能够对犬粪便菌群产生影响,对犬的健康有益。4结论本试验条件下,马里努阿犬幼犬日粮中添加中草药添加剂对粪便微生物丰富度和多样性影响显著,改善肠道菌群组成,显著提升了肠道有益菌(乳酸菌属等)的丰度,降低了肠道致病菌(大肠埃希菌-志贺菌属等),具有潜在的抗菌和抗病作用。本试验研究表明,复方中草药添加量0.2 g/kg的效果相对较优。

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