植物精油具有抗菌、抗氧化等多方面的生物活性功能。植物精油可调控反刍动物瘤胃发酵，影响反刍动物生产性能。石宁等[1]研究表明，添加200 mg/L茴香油可显著提高体外瘤胃发酵液的丙酸浓度。米热古丽·伊马木等[2]研究发现，体外培养条件下，添加150 μL/L的薰衣草精油能够显著提高总挥发性脂肪酸浓度。白云鹏等[3]研究表明，在日粮中添加10 g/d的纯度为1.3%的牛至精油，牛的平均日增重可提高21.7%，料重比降低16.0%。Ebrahimi等[4]研究表明，添加2 mL/d百里香精油可提高犊牛干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率。不同植物精油对瘤胃发酵和饲料消化的影响不完全相同。研究表明，日粮中松针添加量超过一定范围可降低反刍动物采食量和日粮养分消化率[5-6]。松针精油主要化学成分为α-蒎烯、β-蒎烯和石竹烯等，具有抑菌和抗氧化等作用[7]。本试验以体外瘤胃pH值、氨态氮浓度、产气量和挥发性脂肪酸含量等为指标，研究不同浓度松针精油对体外瘤胃发酵的影响，为松针精油在反刍动物体内相关试验提供参考。1材料与方法1.1瘤胃液供体动物及日粮选取3只平均体重相近（40.30±1.53）kg、体质健康的哈萨克育成公羊作为瘤胃液供体。根据《肉羊饲养标准》[8]（NY/T 816—2004）配制日粮，精料和粗料比例为50∶50。基础日粮组成及营养水平见表1。每日9：00和18：00饲喂2次，自由饮水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.016.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00苜蓿干草15.00消化能/(MJ/kg)9.97玉米青贮25.00粗蛋白/%12.78小麦秸秆10.00中性洗涤纤维/%33.61玉米34.00酸性洗涤纤维/%21.18棉粕4.50钙/%0.32麦麸5.00磷/%0.30豆粕5.00石粉0.50食盐0.50预混料0.50注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 1 500 IU、VD 200 IU、VE 20 IU、铁50 mg、铜15 mg、锰40 mg、锌40 mg、锌1.5 mg、钴0.30 mg、硒0.20 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2试验设计采用单因素试验设计，底物中添加不同浓度的松针精油，使各组发酵液中松针精油的浓度分别为0（对照组）、50、100、150、200 mg/L，每组3个重复。另设空白对照组以校正发酵产气量。1.3培养溶液的配制培养溶液采用Menke等[9]的方法配制，包括溶液A（微量元素溶液）、溶液B（碳酸缓冲液）、溶液C（磷酸缓冲液）、Na2S还原溶液以及0.1%的刃天青指示剂。接种前，混合培养溶液（A溶液0.0119%、B溶液和C溶液均为23.8%，还原剂溶液4.75%，指示剂0.1%）混匀，通入CO2气体超过30 min，调节pH值至6.8，39 ℃水浴。1.4发酵底物和松针精油的准备试验采用发酵底物为精料和玉米青贮混合物，比例为50∶50。底物于65 ℃烘干、粉碎、过40目筛，取样0.2 g于发酵器中待用。纯度99%的松针精油（深圳市帝纬嘉生物科技有限公司）与乙醇按一定比例稀释，加入至100 mL体系发酵器，接种培养液稀释为0、50、100、150、200 mg/L的松针精油。1.5培养液接种晨饲2 h后，每只羊采集瘤胃液150 mL，采用4层无菌纱布过滤。以内径32 mm，长200 mm，体积为100 mL玻璃注射器为发酵器。滤液与39 ℃的培养液以1∶2比例混合，取30 mL于发酵器，加入预先配制好的松针精油溶液，密封，（39.0±0.5）℃的水浴摇床中连续培养48 h。1.6发酵参数的测定1.6.1pH值发酵结束，采用pH计（雷磁酸度计）测定发酵液的pH值。1.6.2产气量和干物质降解率发酵结束，读取48 h产气量，测定发酵液的pH值，将发酵器内发酵液倒入经烘干称重的沙芯坩埚中进行过滤和冲洗。滤渣连同坩埚置于105 ℃烘箱，烘干4 h称重。根据发酵前后饲料样中干物质含量，利用差减法计算饲料体外发酵干物质降解率。1.6.3氨态氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）浓度取1.0 mL的发酵液，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，上清液加0.3 mL的25%偏磷酸混匀，4 ℃静置30 min， 10 000 r/min离心10 min，取上清液。发酵液中NH3-N浓度采用苯酚-次氯酸钠比色法[10]测定；MCP浓度采用考马斯亮蓝法[11]测定；VFA浓度采用液相色谱法[12]测定。1.7数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行整理，SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1松针精油对瘤胃体外发酵液pH值及NH3-N、MCP浓度的影响（见表2）由表2可知，不同松针精油添加水平对体外发酵液pH值无显著影响（P0.05）；200 mg/L松针精油组的NH3-N浓度显著低于其他组（P0.05），100、150 mg/L松针精油组的NH3-N浓度显著低于对照组、50 mg/L松针精油组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.016.T002表2松针精油对瘤胃体外发酵液pH值及NH3-N、MCP浓度的影响项目pH值NH3-N/(mg/L)MCP/(mg/L)对照组6.67268.3a214.850 mg/L组6.77265.7a222.3100 mg/L组6.65251.5b220.4150 mg/L组6.73239.6b225.5200 mg/L组6.80224.2c225.3SEM0.0424.9002.920P值0.8450.0100.824注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2松针精油对瘤胃体外发酵液VFA的影响（见表3）由表3可知，200 mg/L松针精油组的总挥发性脂肪酸浓度显著低于其他组（P0.05）；150 mg/L松针精油组的乙酸浓度显著低于对照组和50 mg/L松针精油组（P0.05）；150 mg/L松针精油组的丙酸浓度显著高于其他组（P0.05），乙酸/丙酸显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.016.T003表3松针精油对瘤胃体外发酵液VFA的影响项目总挥发性脂肪酸/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)乙酸/丙酸丁酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)对照组101.98a61.58a27.61b2.21a4.842.971.471.8950 mg/L组101.59a61.30a27.78b2.21a4.832.861.491.84100 mg/L组100.89a60.78ab27.87b2.20a4.842.841.481.86150 mg/L组100.74a59.68b28.76a2.07b4.852.821.451.82200 mg/L组97.95b60.09ab27.06b2.22a4.752.811.441.77SEM0.400.260.180.020.020.020.010.01P值0.0010.0490.0120.0400.3600.0730.3300.0612.3松针精油对瘤胃体外发酵产气量和底物干物质降解率的影响（见表4）由表4可知，200 mg/L松针精油组的产气量显著低于其他各组（P0.05）；200 mg/L松针精油组的干物质降解率显著低于对照组和50、100 mg/L松针精油组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.016.T004表4松针精油对瘤胃体外发酵产气量和底物干物质降解率的影响项目产气量/mL干物质降解率/%对照组66.58a46.76a50 mg/L组66.35a45.98a100 mg/L组65.94a45.51a150 mg/L组65.77a44.78ab200 mg/L组64.46b42.79bSEM0.220.49P值0.0400.0303讨论3.1松针精油对瘤胃体外发酵液pH值及NH3-N、MCP浓度的影响瘤胃pH值是衡量反刍动物瘤胃内环境稳态的重要指标，变动范围为5.0~7.5[13]，与日粮性质、唾液分泌量、有机酸的积累和动物摄食后时间等因素有关。本试验中发酵液的pH值为6.65~6.85，均处于正常范围内，说明添加松针精油对瘤胃微生物的正常发酵代谢并未产生影响，该发酵体系处于稳定状态。NH3-N浓度能够反映瘤胃内氮的供应与利用情况，瘤胃内NH3-N的最佳浓度范围为85~300 mg/L[14]，本试验中各处理组的NH3-N浓度为224.2~268.3 mg/L，能够满足微生物正常发育与生物合成的范围。研究表明，植物精油可降低体外瘤胃NH3-N的浓度[15]。100、150、200 mg/L组的NH3-N浓度均显著低于对照组。瘤胃内的大部分NH3-N由超级产氨菌（HAP）产生。HAP具有极强的脱氨基活性，而植物精油可抑制瘤胃内HAP的活性[16]，降低NH3-N浓度。精油也可通过抑制原虫数量降低瘤胃内NH3-N浓度[17]。MCP浓度能够反映瘤胃内微生物的数量及其摄取和利用NH3-N的能力。本试验发现，不同松针精油添加水平对MCP浓度无显著影响，原因是各组NH3-N浓度对瘤胃MCP的合成无产生影响。3.2松针精油对瘤胃体外发酵液VFA的影响瘤胃内VFA可提供反刍动物60%以上的能量需要，乙酸、丙酸和丁酸是VFA的主要组成部分，其浓度和含量是反映瘤胃消化代谢的重要指标。添加植物精油降低氨态氮浓度和甲烷产量的同时，总挥发性脂肪酸产量下降，不利于反刍动物营养[16]。林波等[18]研究发现，总挥发性脂肪酸浓度随植物精油添加量的增加而降低，且高剂量添加时发酵过程受到显著抑制。本试验发现，总挥发性脂肪酸浓度随发酵液中松针精油浓度的提高而降低，当发酵液中松针精油浓度为200 mg/L时，总挥发性脂肪酸浓度显著下降。原因可能是精油通过抑制瘤胃微生物的活性和细胞间的酶活性，降低了总挥发性脂肪酸的浓度[19]。研究表明，高水平添加植物精油可增加乙酸浓度，降低丙酸浓度，而低添加水平无明显影响[20]。Busquet等[21]研究发现，添加31.2和312.0 mg/L的大蒜油均可降低乙酸浓度、提高丙酸浓度。植物精油的种类和剂量对挥发性脂肪酸各组分的作用也不完全相同。本试验结果表明，与对照组相比，发酵液中松针精油浓度达150 mg/L时，乙酸浓度显著降低，丙酸浓度显著提高；发酵液中松针精油浓度达200 mg/L时，未对丙酸浓度产生影响；200 mg/L松针精油组的丙酸浓度显著低于150 mg/L松针精油组，但乙酸浓度无显著差异。3.3松针精油对瘤胃体外发酵产气量和底物干物质降解率的影响产气量可反映饲料的可发酵程度及瘤胃微生物的活性，是评价瘤胃发酵状态的重要指标之一。产气量与瘤胃微生物的活性和数量密切相关，并且与底物利用率呈正相关[22]。植物精油可能会影响瘤胃微生物对富含淀粉或蛋白质的日粮的附着和定植能力，影响日粮中可溶组分的裂解[23]。曹玉伟等[22]体外试验表明，随着丁子香酚、香芹酚和茴香油浓度的增加，体外瘤胃干物质降解率均呈显著线性下降。研究发现，植物精油会抑制淀粉分解菌和蛋白质水解菌的活性，减少瘤胃原虫和主要纤维素分解菌的数量[24-25]。结合本试验结果，松针精油浓度为200 mg/L时，48 h产气量和干物质降解率显著降低，原因是松针精油抑制了瘤胃微生物的活性，导致瘤胃产气量和干物质降解率降低。4结论本试验表明，发酵液松针精油浓度为150 mg/L时可减少NH3-N浓度，且对总挥发性脂肪酸浓度和干物质降解率无明显影响。本试验条件下，发酵液中松针精油的适宜浓度为150 mg/L。