酵母培养物（YC）是酵母在特定的培养基上充分发酵形成的微生态制品，含发酵底物、菌体蛋白和代谢产物等，可提高动物机体免疫力和调节瘤胃微生物等[1-2]。卢奇成[3]研究发现，在犊牛日粮中添加3.0 g/(头·d)和5.0 g/(头·d)布氏酵母菌21 d后血清中IgA和IgG含量显著高于其他组。朱晋佳等[4]研究发现，在泌乳前期和泌乳中期日粮中添加不同酵母菌（乐斯福酵母、富硒酵母及二者混合物），与对照组相比，各试验组中IgA和IgM含量无明显差异。孔义川[5]研究发现，在犊牛日粮中添加YC显著提高了犊牛血清葡萄糖含量。Stella等[6]研究发现，在日粮中添加活酵母未对奶山羊的血糖含量产生显著影响。Dawson等[7]对50多种酵母菌株进行研究，发现只有7种菌株可有效刺激纤维分解细菌与乳酸利用菌活性，其他菌株无作用或作用甚微。Carpinelli等[8]研究发现，在围产前后奶牛日粮中添加YC可显著提高埃氏巨型球菌和溶淀粉芽孢杆菌相对丰度，有提高产琥珀酸纤维杆菌相对丰度的趋势。Halfen等[9]在泌乳中期奶牛日粮中添加YC，结果发现，YC组奶牛的产琥珀酸纤维杆菌和溶淀粉芽孢杆菌丰度显著降低。上述研究结果存在差异，可能是由添加剂的种类、剂量、添加方式以及试验动物不同导致。目前，市场上酵母培养物种类繁多，营养成分、代谢产物、加工工艺等存在一定差异，使用效果不完全相同。本试验旨在泌乳早期荷斯坦奶牛日粮中添加3种酵母培养物，研究酵母培养物对泌乳奶牛血液指标和瘤胃微生物的影响，为酵母培养物在泌乳奶牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料酵母培养物1（YC1）、酵母培养物2（YC2）和酵母培养物3（YC3）的成分含量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T001表13种酵母培养物成分含量种类主要成分营养成分含量/%YC1酿酒酵母培养物（酵母菌）粗蛋白≥12.0、粗灰分≤8.0、水分≤11.0YC2酵母培养物、酶制剂（酵母菌、芽孢杆菌）粗蛋白≥18.0、粗灰分≤8.0、水分≤10.0YC3酿酒酵母培养物（酵母菌）粗蛋白≥20.0、粗灰分≤6.0、水分≤10.01.2试验设计试验于2020年11月9日至2021年1月7日，于保定市满城区宏达牧业有限公司进行，试验期60 d。选取64头胎次（2.80±0.28）胎、泌乳天数（46.30±2.89）d和产奶量（41.5±1.20）kg相近的健康荷斯坦奶牛，随机分为4组，每组16个重复，每个重复1头牛。各组奶牛分别饲喂150 g/(头·d) YC1（市面广泛认可，阳性对照组）、80 g/(头·d) YC2（L-YC2组）、100 g/(头·d) YC2（H-YC2组）和40 g/(头·d) YC3（YC3组）。参照NRC（2001）标准配制全混合日粮（TMR），基础日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T002表2基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00全株玉米青贮27.88产奶净能/(MJ/kg)6.71苜蓿干草14.73粗蛋白质/%15.80燕麦草4.32粗脂肪/%3.89全棉籽6.52中性洗涤纤维/%33.91蒸汽压片玉米18.12酸性洗涤纤维/%20.77豆粕11.12钙/%0.92甜菜颗粒9.61磷/%0.47小麦麸皮1.67膨化大豆2.09脂肪粉0.78氧化镁0.15磷酸氢钙0.73石粉0.42小苏打0.52食盐0.21碳酸钾0.08过瘤胃蛋氨酸0.05预混料0.98脱霉剂0.02注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 700 000 IU、VD3 250 000 IU、VE 10 000 IU、铜1 700 mg、铁1 860 mg、锌7 512 mg、锰4 030 mg、钴62 mg、硒50 mg、碘100 mg。2.营养水平中产奶净能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验牛自由采食和饮水，散栏饲养，每日饲喂2次（10：00、17：00），挤奶3次（9：30、16：30、22：30）。牛舍定期消毒，保持牛舍内外的干燥和卫生。1.4测定指标及方法1.4.1血样采集试验第0、30、60 d，每组选取8头牛，晨饲前尾根静脉采血。血样37 ℃水浴10 min后离心，取上清液-20 ℃保存。1.4.2瘤胃液采集试验第0、30、60 d，每组随机选取8头牛（与采血牛相同），晨饲前采集牛瘤胃液。瘤胃液冻存于液氮，回实验室后于-80 ℃超低温冰箱冻存。1.4.3血液指标采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定血液中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）含量及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。采用北京华悦昌生物科技有限公司试剂盒，使用酶联免疫吸附法测定血清中的非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）、瘦素（LEP）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）。1.4.4瘤胃菌群瘤胃细菌区系采用16S测序分析，MagPure Soil DNA LQ Kit、D6356-03试剂盒抽提DNA进行检测。以质检合格的DNA作为模板，进行16S rRNA基因V3~V4区RCR扩增，采用标准Illumina TruSeq DNA文库制备试验流程构建所需的上机文库。1.5数据统计与分析数据采用SAS 9.4软件MIXED程序进行分析，处理为主效应，奶牛为随机效应，为了消除0 d存在的差异，将0 d结果作为协变量参与分析，差异显著采用Duncan's法进行多重比较检验。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著，0.05P≤0.10表示有差异趋势。2结果与分析2.1不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛血液生化指标的影响（见表3）由表3可知，试验第30 d时，H-YC2组奶牛血液中TG含量显著高于YC1组和YC3组（P0.05）；H-YC2组和YC3组奶牛血液中的TC含量著高于YC1组（P0.05）；H-YC2组奶牛血液中IGF-1浓度显著低于其他组（P0.05）；H-YC2组奶牛血液中BUN含量显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T003表3不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛血液生化指标的影响项目YC1组L-YC2组H-YC2组YC3组SEMP值GLU/(mmol/L)3.843.933.523.930.230.45TG/(mmol/L)0.48b0.57ab0.63a0.45b0.050.02TC/(mmol/L)4.00b5.19ab6.59a6.30a0.500.05NEFA/(μmol/L)450.60553.90465.6452.8037.300.22BHBA/(μg/L)602.20651.30761.3613.9045.500.08BUN/(mmol/L)2.50b2.81b4.46a3.38b0.310.01LEP/(μg/L)6.676.675.966.210.530.72IGF-1/(μg/L)205.00a204.20a145.40b190.10a13.800.02注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛肝脏功能及抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，试验第30 d时，H-YC2组奶牛血液中ALT活性显著高于L-YC2组和YC3组（P0.05）。YC3组奶牛血液中T-AOC活性显著低于L-YC2组和H-YC2组（P0.05）；YC1组和YC3组奶牛血液中MDA含量均显著高于L-YC2组（P0.05），且H-YC2组显著低于YC1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T004表4不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛肝脏功能及抗氧化指标的影响项目YC1组L-YC2组H-YC2组YC3组SEMP值ALT/(U/L)7.05ab5.39b8.17a5.65b0.780.05AST/(U/L)8.618.6510.807.960.920.21T-AOC/(U/mL)6.31ab7.19a7.21a5.63b0.440.02SOD/(U/mL)231.60238.70244.00190.1017.600.16GSH-Px/(U/mL)99.50110.4091.8097.6014.500.78MDA/(mmol/L)7.18a5.06c5.83bc6.86ab0.400.012.3不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛瘤胃微生物Alpha多样性的影响（见表5）由表5可知，不同处理组试验第30 d时的Chao1、Observed_species、Shannon指数和Simpson指数均无显著差异（P0.05)。但与YC1组相比，YC3组奶牛瘤胃Shannon指数存在降低趋势（P=0.09）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T005表5不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛瘤胃微生物Alpha多样性的影响项目YC1组L-YC2组H-YC2组YC3组SEMP值Chao1/(×103)11.7012.7010.8010.700.730.23Observed species/(×103)8.779.468.177.880.510.17Shannon11.2011.5011.1010.600.240.09Simpson1.001.001.001.000.010.132.4不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛瘤胃菌群组成的影响（见表6、表7）由表6可知，试验第30 d时，L-YC2组奶牛瘤胃中纤维杆菌门相对丰度显著低于H-YC2组和YC3组（P0.05）；H-YC2组奶牛瘤胃中蓝藻门相对丰度显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T006表6不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛门水平瘤胃菌群组成的影响项目YC1组L-YC2组H-YC2组YC3组SEMP值拟杆菌门57.8061.3059.3060.302.510.77厚壁菌门36.5034.9035.9033.802.840.92变形菌门2.010.561.433.120.900.26螺旋菌门0.801.071.451.140.200.19SR10.670.460.410.820.170.35软壁菌门0.310.400.370.310.040.27TM70.350.350.370.370.030.90放线菌门0.290.150.110.140.050.10纤维杆菌门0.15b0.11b0.26a0.28a0.280.01蓝藻门0.03b0.02b0.06a0.04b0.010.01%由表7可知，不同酵母培养物对奶牛瘤胃属水平细菌组成均无显著影响（P0.05)。各组奶牛瘤胃中均以普雷沃氏菌属相对丰度最高，各处理组Shuttleworthia相对丰度无显著差异，但L-YC2组Shuttleworthia的相对丰度较YC3组有降低趋势（P=0.07）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.001.T007表7不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛属水平瘤胃菌群组成的影响项目YC1组L-YC2组H-YC2组YC3组SEMP值普雷沃氏菌属43.1047.9041.3039.003.130.26琥珀酸菌属6.176.296.165.580.570.82瘤胃球菌属2.191.812.082.050.260.76丁酸弧菌属1.361.541.161.370.160.43粪球菌属0.890.730.821.120.160.37密螺旋体属0.761.061.400.950.180.12YRC220.970.630.790.810.100.12Shuttleworthia0.520.350.240.790.150.07CF2310.760.810.800.640.080.42梭菌科-梭状芽孢杆菌属0.570.620.660.550.070.65%3讨论3.1不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛血液生化指标的影响血清TG和TC含量可反映脂类的吸收和代谢状况。张学峰等[10]研究发现，连续21 d向瘤胃灌注1.50%和2.0%YC可显著降低绵羊血清TG含量。杨云天[11]研究发现，在日粮中添加酵母对青年奶山羊血清TG含量无显著影响。陈亮等[12]研究发现，在日粮中添加120 g/kg的YC可显著提高湘中黑牛血清TC含量，添加240 g/kg的YC可显著降低血清TC含量。Kowalik等[13]研究表明，TG含量升高可能是酵母制剂提高脂肪酶活性及日粮脂肪的利用率所致。本试验中，试验第30 d时，H-YC2组奶牛血液中TG和TC含量显著高于YC1组，原因可能是H-YC2组中所含的酶制剂促进了日粮中脂肪的吸收与利用，也可能是H-YC2组中酵母菌和芽孢杆菌共同作用，可更好地提高瘤胃内脂肪酶的活性，加快脂肪代谢。血清NEFA和BHBA均可反映机体的能量平衡状态。刘瑾[14]研究发现，产甘油YC中富含甘油，而甘油作为肝脏糖异生的前体可在肝脏中转化为GLU，也会在瘤胃发酵生成丙酸盐作为糖异生的前体被利用，生成的GLU会刺激胰岛素分泌，进而减少脂肪被分解成NEFA。Yuan等[15]和Halfen等[9]研究发现，添加酶解酵母和YC后可增加血清中BHBA含量。Yuan等[15]研究发现，酶解酵母和YC还存在显著的二次剂量效应。本试验中，各组奶牛血液中的BHBA和NEFA含量不存在显著差异，与上述研究存在差异的原因可能与试验动物、YC所用的菌株和剂量不同有关。但H-YC2组奶牛血液中的BHBA含量比L-YC2组相比有增加趋势，可能是高剂量添加YC后加快了机体的脂肪代谢。血清尿素浓度与氮的循环和瘤胃蛋白的降解高度相关[16]。奶牛血清BUN含量范围一般为2~8 mmol/L，当机体肾功能受损时，BUN含量升高[17]。本试验中，试验第30 d时，H-YC2组奶牛血液的BUN含量显著高于其他组，与李琛等[18]研究相似。原因可能是高剂量添加YC后破坏了瘤胃的能氮平衡，导致瘤胃内氨氮浓度升高，瘤胃壁吸收后进入肝脏，合成尿素，使BUN含量升高。因此，本试验中高剂量使用YC会影响氨氮浓度的利用。血清IGF-1可促进糖原、蛋白和脂肪的合成，调节血糖[19]。Inaba等[20]认为，血液IGF-1主要与机体氮代谢有关。张翔飞[21]在肉牛日粮中添加0.10%的酵母，结果发现，与对照组相比，酵母组肉牛各时期血清中IGF-1水平均有所升高，并在30 d时出现显著差异，说明添加酵母后可促进肉牛对氮的利用。本试验中，第30 d时，H-YC2组奶牛血液中的IGF-1浓度显著低于其他3组，与上述研究结果不同，原因可能是添加YC的菌株不同、营养成分和剂量不同。因此，高剂量添加YC可能会抑制瘤胃内蛋白分解菌的活性，打破机体能氮平衡，进而影响机体对氮的利用。3.2不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛肝脏功能及抗氧化的影响ALT和AST是反映肝脏功能的重要指标[22]。王玲等[23]研究发现，添加复合酵母培养物对奶牛血清中ALT活性无显著影响，与本试验结果不一致。本试验中，试验第30 d时，H-YC2组奶牛血液中的ALT活性显著高于L-YC2组和YC3组，可能是由于YC种类、剂量不同和试验动物的生理阶段及所处环境不同造成，但均在正常范围内，表明日粮添加YC不会对机体造成损伤，但不同剂量可影响酶的活性。MDA含量和T-AOC可反映机体的抗氧化能力[24]。王卫正等[25]发现，在泌乳中期奶牛日粮中添加3.0% YC可极显著提高血液SOD活性。程艳[26]的试验也得到类似结论，奶牛日粮中添加YC也使血浆中MDA含量显著降低。本试验中，试验第30 d时，L-YC2组和H-YC2组奶牛血液中的T-AOC显著高于YC3组，MDA含量显著降低，表明该组抗氧化能力较优于其他2组，可能是YC2中的酵母菌和芽孢杆菌共同作用能更好地加快机体的自我修复能力。本试验中，GSH-Px活性略微降低，可能是因为机体内硒等营养素达到一定水平后会抑制GSH-Px的合成，具体机制有待进一步研究[27]。3.3不同酵母培养物对30 d泌乳奶牛微生物菌群的影响多样性指数可反映微生物的丰富情况。通过16S测序发现，本试验中测序深度能够真实反映菌群结构。研究表明，拟杆菌门和厚壁菌门是反刍动物瘤胃中的优势菌群[28-30]。本试验中，优势菌群为拟杆菌门和厚壁菌门，与上述研究结果研究一致。在相同日粮中，添加不同的YC对菌群相对丰度的影响也不完全相同。本试验中，H-YC2组奶牛瘤胃中的纤维杆菌门和蓝藻门相对丰度显著高于L-YC2组，表明在相同日粮水平中添加同一产品不同剂量的YC会影响到菌群结构。普雷沃氏菌属广泛存在于瘤胃中且丰度较高，能够降解利用淀粉与植物细胞壁多糖[31-32]。本试验各组间奶牛瘤胃细菌以普雷沃氏菌属的丰度较高，琥珀酸菌属为第二优势菌属，与Jiang等[33]试验结论一致。4结论日粮添加不同种类、不同剂量的YC可对奶牛血液指标和瘤胃微生物产生不同的影响。本试验条件下，YC1效果最好，YC3效果与YC1接近。日粮中添加高剂量YC时，可对机体代谢和瘤胃微生物产生影响。建议在奶牛生产中根据饲喂效果和经济效益选择适宜的酵母培养物。