动物肠道内存在细菌、古菌及真菌，多数为厌氧细菌[1]。肠道微生物具有促进机体物质能量交换、信息传递、宿主营养物质消化吸收、免疫系统建立以及促生长的作用[2]。猪肠道微生物环境易受遗传因素影响[3]，也受日粮组成成分的影响。日粮是调节肠道微生物结构和代谢的主要因素，日粮蛋白水平通过影响猪肠道营养物质的消化吸收，进而影响猪肠道内微生物菌群的稳态。日粮中添加适宜水平的蛋白可影响肠道微生物群落组成，改善肠道屏障功能[4]。Liu等[5]研究发现，日粮中添加高蛋白水平（HP）可提高仔猪盲肠微生物菌群的多样性、丰富性。张桂杰等[6]研究发现，与18%正常蛋白质日粮相比，16%低蛋白日粮具有提高空肠绒毛高度趋势，能够维持猪的正常生长性能，改善肠道健康。适当的日粮能量水平能够提高动物生长速度，避免浪费能源物质。青海八眉猪具有产仔多、母性好、肉质优良、脂肪沉积能力强、抗逆性强、配合力高等特性[7]，与引进品种猪杂交可获得明显的杂种优势，可有效改善原种生长发育慢、背膘及皮较厚的缺点[8]。本试验选择“巴克夏×八眉猪”杂交后的F2代（简称“巴×八”二元猪），通过饲喂不同能蛋比水平的日粮，测定其生长性能及体尺，利用16S rRNA基因高通量测序技术对粪便内菌群进行测序分析，确定“巴×八”二元猪日粮适宜的能蛋比。1材料与方法1.1试验设计试验于青海互助县八眉猪原种育繁场实施开展。选取遗传背景一致的“巴克夏×八眉猪”F2代健康仔猪27头。随机分为3组，每组3个重复，每个重复3头猪。参照《猪饲养标准》（2004）配制饲喂日粮，基础日粮组成及营养水平见表１。G1组仔猪饲喂能蛋比（DE/CP）为0.96的日粮；G2组饲喂DE/CP为0.87的日粮；G3组饲喂DE/CP为0.80的日粮。1.2饲养管理试验猪转入各组，常规免疫注射和饲料过渡。预试期7 d，正式试验期57 d。每天饲喂3次（7：00、12：00和18：00），猪自由采食、饮水。日常管理按照规模化养殖场常规饲养方法，舍内保持干燥，注意消毒通风。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验猪测定初重及末重，计算平均日增重；记录每日饲料消耗量，计算平均日采食量；根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。试验开始前及结束当天测定体高、体长、胸围、臀围、背膘厚等体尺指标。总增重=末重－初重(1)平均日增重=总增重/正式试验天数(2)平均日采食量=饲养期内总的采食量/试验天数(3)料重比=平均日采食量/平均日增重(4)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目G1组G2组G3组原料组成/%玉米56.9655.8258.11大豆粕2.177.1312.04苜蓿草粉18.0012.0010.35小麦麸14.5713.464.00菜籽饼4.006.5910.00大豆油0.301.001.50预混料4.004.004.00合计100.00100.00100.00营养水平消化能/(MJ/kg)11.5112.1412.77粗蛋白/%12.0014.0016.00钙/%0.6000.5500.555总磷/%0.4000.4310.409能蛋比0.96∶10.87∶10.80∶1注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 160 kIU、VD3 50 kIU、VE 1 500 mg、VK3 80 mg、VB1 45 mg、VB2 110 mg、VB6 80 mg、烟酸600 mg、泛酸300 mg、叶酸10 μg、铁4 500 mg、铜250 mg、碘50 mg、硒10 mg、钙17.5%、磷1.8%、赖氨酸5%、氯化钠9.5%。2.营养水平均为计算值。试验第1 d和最后1 d，测定猪的体高、体长、胸围、臀围，记录。采用盛诺维V5+智能兽用超声诊断系统测定背膘厚，多次测定取平均值。1.3.2粪便微生物试验结束当天，采集试验猪新鲜粪便于2 mL冻存管，放于液氮罐，-80 ℃保存。采用E.Z.N.ATM粪便DNA提取试剂盒提取DNA。对粪便微生物样品的DNA使用16S rRNA的可变V3~V4区进行PCR扩增。上游引物338 F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'；下游引物1 046 R：5'-CGACAGCCATGCANCACCT-3'。PCR反应程序：94 ℃ 4 min，25个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min。PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，随即进行切胶回收，使用PCR纯化试剂盒进行纯化。16S rRNA的V3~V4区的PCR扩增产物通过Illumina公司MiSeq PE-300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。采用QIIME软件定量分析中，B2C2软件进行嵌合体检测和去除。合格的序列使用UCLUST算法97%相似度阈值进行操作分类单元划分（OTUs），筛选第一条序列作为每个OTU的代表序列。对OUT进行Alpha、Beta多样性分析，对生长性能表型数据和肠道微生物菌群定量数据进行关联性分析。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2010进行整理，SPSS 20.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪生长性能及体尺测定的影响（见表2、表3）由表2可知，G2组、G3组仔猪的末重、平均日增重均显著高于G1组（P0.05）；G1组、G3组仔猪的饲料消耗量、平均日采食量均显著高于G2组（P0.05），G1组和G2组差异不显著（P0.05）。G2组、G3组仔猪的料重比显著低于G1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.T002表2不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg饲料消耗量/kg平均日增重/[kg/(头·d)]平均日采食量/[kg/(头·d)]料重比G1组28.00±2.9442.50±3.39b78.81±3.99a0.26±0.04b1.38±0.07a5.55±1.07aG2组29.08±2.3149.25±2.09a70.92±3.36b0.35±0.05a1.25±0.06b3.58±0.58bG3组29.30±3.1152.80±4.58a80.85±1.63a0.41±0.06a1.42±0.03a3.50±0.51b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。由表3可知，G3组与G2组仔猪的末体高、末臀围均显著高于G1组（P0.05）。末体长由大到小依次为G3组G2组G1组（P0.05）；G3组仔猪的末背膘厚度最高，显著高于G2和G1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.T003表3不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪体尺的影响项目G1组G2组G3组初始体高40.75±2.9942.33±1.9741.60±2.79初始体长78.50±3.0082.00±3.3581.40±3.58初始胸围69.25±2.2270.33±1.0372.00±3.16末体高50.00±2.58b53.67±1.97a55.20±2.17a末体长95.25±1.26c101.67±1.21b107.80±4.21a末胸围81.50±2.3885.50±2.6788.00±7.97末臀围57.25±2.87b62.67±2.42a64.60±3.78a末背膘厚17.60±0.35b17.73±0.26b18.32±0.26a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。cm2.2仔猪肠道菌群Alpha多样性分析（见图1）Alpha多样性可反映样品物种丰度及多样性。由图1可知，G1组仔猪的Ace指数最高，表明G1组菌群物种丰度高于其他两组；G1组Shannon指数最大，Simpson指数最小，表明G1组群落多样性最高。Observed指数由高到低为G1组G3组G1组。表明高能蛋比饲喂的G1组肠道菌群具有更高的丰度和多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F001图1仔猪肠道菌群Alpha多样性分析2.3仔猪肠道微生物β多样性分析（见图2）图2仔猪肠道微生物β多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F2a1（a）PCoA分析图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F2a2（b）OTU分布Venn图由图2（a）可知，PcoA axis1贡献率63.22%、PCoA axis2贡献率16.95%时，G1组样品位置紧密，G3组位置疏散，说明G1组组内菌群多样性差异最小，G3组组内菌群差异性最大。Adonis分析各间菌群多样性差异不显著（P0.05）。由图2（b）可知，3组共有OUT数110个，G1组有OUT数18个，G2组独有的OUT数9个，G3组独有的OUT数14个，其中G1组独有OTU数目最多，表示拥有较多特有微生物种类。2.4微生物群落组成分析（见图3）图3粪便中微生物群落在门、属水平上的分布及结构差异性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F3a1（a）门水平上的物种相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F3a2（b）属水平上的物种相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F3a3（c）微生物群落差异性分析本试验共检出423个OTUs，分别属于14个门，23个纲，47个目，80个科，177个属。由图3（a）可知，3组样本优势菌门主要由厚壁菌门（Firmicutes）、螺旋体门（Spirochaetota）和拟杆菌门（Bacteroidota）组成，占整个菌群的98%以上。次级优势菌门为放线菌门（Actinobacteriota）、蓝藻门（Cyanobacteria）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、变形菌门（Proteobacteria）、纤维杆菌门（Fibrobacterota）、细菌门（Bacteria）。门水平排名前10中，组间差异较大的菌门为Firmicutes、Spirochaetota、Bacteroidota和Patescibacteria。Firmicutes与Bacteroidota的比值分别为G1组26.51、G2组37.07、G3组26.75。由图3（b）知，各组前3的优势菌属有所差异，G1组和G2组优势菌属为梭菌属（Clostridium）、土孢杆菌属（Terrisporobacter）和苏黎世杆菌属（Turicibacter），G3组优势菌属为Clostridium（27.37%）、链球菌属（Streptococcus，12.57%）及Terrisporobacter（11.39%）。Clostridium和Terrisporobacter呈下降趋势；Streptococcus呈上升趋势，G3组丰度为12.57%，G1组中该菌仅为G3组的1/2（6.80%）；Turicibacter呈先降后升的趋势。除前3优势菌属外，其他丰度较高的菌属有罗姆布茨菌属（Romboutsia）、密螺旋体属（Treponema）、克里斯滕森菌科R-7群（Christensenellaceae_R-7_group）、梭菌科UCG-014（Clostridia_UCG-014）、梭菌科UCG-005、毛螺菌属（Lachnospiraceae）。由图3（c）可知，共有25个显著差异属，包括Terrisporobacter、韦荣球菌属（Erysipelotrichaceae）、毛螺菌科_AC2044群（Lachnospiraceae_AC2044_group）、伊格尔兹氏菌属（Eggerthellaceae）、索拉杆菌属（Solobacterium）、粪球菌属（Coprococcus）、Lachnospiraceae、韦荣球菌科_UCG-002（Erysipelotrichaceae_UCG-002）、芽孢杆菌属（Bacillus）等。随着日粮中能蛋比水平下降，G3组显著低于G1组的菌属为Terrisporobacter、Erysipelotrichaceae、毛螺菌科_AC2044群（Lachnospiraceae_AC2044_group）、伊格尔兹氏菌属（Eggerthellaceae）。Solobacterium呈下降趋势，且G2组、G3组均显著低于G1组（P0.05）；Coprococcus呈先降后升的趋势，G3组显著高于G2组（P0.05）；Lachnospiraceae呈先下降后上升趋势，G2组、G3组均显著低于G1组（P0.05）。Erysipelotrichaceae_UCG-002呈下降趋势，G3组中未检出，显著低于G1组（P0.05）；Bacillus仅在G3组出现（0.09%），显著高于其他两组（P0.05）。2.5生长性能及体尺性状与微生物菌群的相关性分析（见图4）由图4可知，试验猪的平均日增重（ADG）与颤螺旋菌属（Oscillospira）呈极显著正相关（P0.01），与Solobacterium呈极显著负相关（P0.01）；试验猪粪便中霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）、Bacillus、韦荣球菌科_UCG-003（Erysipelotrichaceae_UCG-003）和肠杆菌属（Intestinibacter）与平均日采食量（ADF）和饲料消耗量（FC）呈显著正相关（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.006.F004图4粪便菌群属水平相对丰度与生长性能及体尺参数的相关分析注：*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）。试验猪的料重比（F/G）与Lachnospiraceae呈极显著正相关（P0.01），与Oscillospira呈极显著负相关（P0.01）；试验猪的体重（BW）与Butyricicoccaceae呈显著正相关（P0.05），BW与Erysipelotrichaceae_UCG-002、Lachnospiraceae和Solobacterium呈显著负相关（P0.05）。试验猪的体高（BH）与Erysipelotrichaceae_UCG-003、普氏菌科_UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、Solobacterium和Erysipelotrichaceae呈显著的负相关（P0.05）；Lachnospiraceae和Solobacterium与试验猪的体长（BL）呈极显著负相关（P0.01）；Frisingicoccus、Bacillus、Butyricicoccaceae和Coprococcus与试验猪的胸围（CC）呈极显著正相关（P0.01）；Lachnospiraceae和Solobacterium与试验猪的臀围（HC）呈显著负相关（P0.05）；Butyricicoccaceae与试验猪的背膘厚（BF）呈极显著正相关（P0.01）。3讨论3.1不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪生长性能及体尺的影响能量与蛋白质是动物生产和生命活动必不可缺的养分[9]，对提高猪生长性能与控制饲料成本平衡极其重要。本试验中，随着日粮能蛋比水平降低，试验猪的平均日增重和饲料消耗量均呈上升趋势，说明猪能够调节进食水平，从而满足自身营养需要，与赵智华等[10]研究结果一致。较高水平能量和蛋白水平可以提高平均日增重及各项体尺指标[11]。但过高能蛋比日粮会导致成本过高，降低利润；过低能蛋比日粮不能满足猪的生长需要，当能蛋比最佳时，才能表现出最大化生产效益和经济效益[12]。3.2不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪粪便微生物的多样性及丰度的影响动物粪便中存在的微生物反映了肠道微生物群落总体组成[13]。日粮因素可引起动物肠道微生物多样性和丰富度产生变化[14]。Shannon指数和Simpson指数通常反映肠道菌群多样性；Ace指数是估计物种总数常用指数，Ace指数数值越大，表明群落丰富度越高[15]。本试验中，随着日粮中能蛋比水平降低，蛋白水平呈上升趋势，粪便微生物的丰富度和多样性均有所降低，与Wan等[16]发现一致。3.3不同能蛋比日粮对“巴×八”二元猪粪便菌群组成的影响日粮中蛋白和能量水平可以影响肠道微生物组成[14,17]。研究表明，降低饲粮蛋白水平（16% CP降至10% CP）能够降低育肥猪Firmicutes和Bacteroidota相对含量[18]，高能量饮食能够导致巴马小型猪Firmicutes丰度增加，Bacteroidota丰度下降[17]。Mirjana等[19]研究表明，高蛋白饲粮显著增加了粪样中埃希氏大肠杆菌数量，减少了双歧杆菌属细菌数量。不同蛋白水平对肠道微生物组成的影响有所不同，低蛋白日粮可降低肠道pH值，有利于营养物质吸收，抑制有害菌活动。若机体摄入过多蛋白，未被消化的蛋白质会进行厌氧发酵[20]。蛋白质发酵往往伴随着细菌病原体生长，如拟杆菌属（Bacteroides）、Clostridium细菌[21]。富含饱和脂肪（如牛奶）的饮食可以引发δ-变形杆菌（δ-Proteobacteria）的生长[22]。高脂饮食会导致Roseburia属物种的数量显著减少[23]。研究表明，饲喂高脂饲粮的大鼠中γ变形杆菌纲肠杆菌目（Enterobacteriales）成员的相对丰度显著增加[24]。研究表明，Firmicutes和Bacteroidota是猪肠道微生物的优势菌门[25]。本研究中，3组样本具有相同分布方式，均以Firmicutes、Spirochaetota和Bacteroidota门占优势。但张冬杰等[26]在对民猪肠道菌群研究中发现，门分类水平下占比最高的是Bacteroidota、Firmicutes和Spirochaetota，此结果与本研究结果存在差异。原因可能与试验猪遗传背景、试验饲料的不同有关。研究表明，不同猪种在相同生理阶段的菌群结构与主要菌群数量均有差异[27]。Firmicutes、Bacteroidota细菌与碳水化合物代谢有关[28]，二者还参与机体氮代谢，分泌蛋白酶，影响肠道中蛋白质发酵[29]。Firmicutes还与宿主能量摄入有关[30]。冯宝宝[31]研究表明，当肠道内Firmicutes细菌增多，Spirochaetota细菌减少时，宿主摄取能量、沉积脂肪的能力增强。Spirochaetota可降解饲料中纤维素、果胶、磷酸酯等，形成挥发性脂肪酸，为动物机体供能。本研究中，G2组Bacteroidota、Firmicutes和Spirochaetota相对丰度最高，但G3组生长性能最优，说明肠道菌群不是影响个体生长性能的唯一因素。本试验中，Firmicutes与Spirochaetota的比值与谭占坤[32]在“杜长大”中26.97的比例相近，原因是本试验中父本使用国外猪种。康润敏等[33]在不同品种猪上的研究表明，Spirochaetota可参与纤维素的降解，本研究中，Spirochaetota菌门在G1组丰度最高，原因是G1组日粮纤维含量最高。研究表明，变形菌门与不稳定的肠道微生物群落和代谢紊乱相关[34]，与本研究中该菌在G1组丰度最高而生长性能最低的结果相一致。研究表明，梭菌属和毛螺菌科细菌是肠道内主要的纤维降解菌[32]。本研究中，梭菌属、毛螺菌科_AC2044群的丰度与日粮中纤维添加量的下降趋势保持一致，与上述研究结果相同。土孢杆菌属多在小体重且厌食鸡肠道内富集[35]。本试验中，G1组土孢杆菌属丰度最高，生长性能为3组中最低，与上述研究结果相一致。Streptococcus作为乳酸菌的一种，具有分解蛋白和脂肪的功能[36]，分解后可产生挥发性脂肪酸，降低肠道pH值，使肠道环境不利于有害菌增殖，促进动物健康[37]。高蛋白日粮可增加粪样中链球菌属丰度[14]。本试验中，随着日粮中能蛋比水平下降，蛋白含量呈增加趋势，链球菌属相对丰度呈上升趋势，与上述研究结果一致。链球菌属可能促进炎症发生，破坏肠道菌群平衡[38]。Erysipelotrichaceae、Eggerthellaceae和Solobacterium作为肠道有害菌[39]，韦荣球菌属能引起猪的腹泻，伊格尔兹氏菌属能够促进炎症作用[40]，Solobacterium在菌血症人群中富集[41]。本试验中3种菌属均呈下降趋势，说明日粮能蛋比降低能够促进肠道保持健康。球菌属（Coprococcus）能够减少肠道炎症，确保肠道对营养物质的吸收[42]。与本试验G3组该菌丰度最高、生长性能最优的结果一致。Bacillus仅在生长性能最优的G3组中出现，可以提高猪平均日增重、平均日采食量[43]。3.4仔猪的生长性能及体尺与显著差异菌属的相关性分析肠道菌群与猪生长性状具有显著相关性[44]。肠道菌群会通过多种方式对机体产生影响，一些菌属对猪生长性能和体尺具有调控作用。Oscillospira普遍存在于猪胃肠道中[45]，能够分泌为宿主提供能量的短链脂肪酸[46]，与体重增长呈正相关[47]。日粮中添加Bacillus可以提高猪平均日增重，改善平均日采食量，降低料重比[43]。研究表明，芽孢杆菌可以提高猪肠道吸收营养物质的能力，改善机体肠道内环境，进而有效提高育肥猪生产性能[48]，与本试验中生长性能最优的G3组出现芽孢杆菌结果一致。研究发现，Lachnospiraceae丰度与猪饲料利用效率呈正相关[49]。本研究中，Butyricicoccaceae与胸围、背膘厚呈极显著正相关，与体重、体长呈显著正相关，与司景磊[44]研究结果一致。4结论随着日粮能蛋比水平降低，试验猪的平均日增重有上升趋势，料重比呈下降趋势，各项体尺指标有增加（如背膘厚等）。3组样本中优势菌门均为厚壁菌门、螺旋体门和拟杆菌门；G1组、G2组优势菌属为梭菌属、土孢杆菌属和Turicibacter，G3组优势菌属为梭菌属、链球菌属以及土孢杆菌属。能蛋比低的日粮能够提高颤螺旋菌属、芽孢杆菌、Butyricicoccaceae的相对丰度，显著降低毛螺菌属的相对丰度。Butyricicoccaceae与体重、背膘厚等指标呈显著正相关，芽孢杆菌属与饲料消耗量和平均日增重等指标呈显著正相关，毛螺菌属与体重、体长、胸围等指标呈显著负相关，而颤螺菌属与平均日增重呈极显著正相关，与料重比呈极显著负相关。因此，“巴×八”二元猪最适宜的能蛋比为0.80。