全混合日粮（TMR）是一种根据奶牛营养需求和生理阶段将粗饲料、精饲料和添加剂按照一定比例混合而成的、营养平衡的日粮，能够满足奶牛生长、生产需要，保障动物健康[1-3]。TMR水分含量约为50%，暴露在高温、高湿、有氧环境下易发霉、发热和变质。夏季TMR有氧稳定性更差，易导致营养物质损失、动物采食量下降，还会引起动物的不良反应甚至发生疾病。因此，有效保证TMR的有氧稳定性对奶牛生产和健康十分重要[4]。生物饲料是通过发酵工程技术开发制成的饲料[5]。研究发现，通过旋转蒸发提取生物饲料的浓缩液能够有效抑制大肠杆菌的生长繁殖[6]，对有害菌具有一定抑制作用。判断TMR有氧稳定性的指标有二氧化碳生成量、干物质损失、pH值变化和温度变化[7-8]。TMR温度上升至比环境温度高2 ℃时，表明TMR已变质[9-10]。本试验通过测定TMR温度变化和霉菌生长，研究青贮品质和生物饲料对TMR有氧稳定性的影响，为提高奶牛TMR有氧稳定性提供参考。1材料与方法1.1试验材料生物饲料发酵菌种由生物饲料开发国家工程研究中心提供，枯草芽孢杆菌（保藏号：CGMCC NO.13131）、酿酒酵母菌（保藏号：CGMCC NO.13133）及植物乳杆菌（保藏号：CGMCC NO.13132）按1∶1∶1比例混合，与饲料原料按配方混合，每吨饲料中加入1 kg发酵菌种，饲料经呼吸袋发酵，制成生物饲料。生物饲料pH值为4.0~5.0，总酸含量为1.5%~3.0%。1.2试验设计TMR日粮组成见表1。新鲜青贮，使用全混合日粮按照表1组成配制TMR，为青贮未二次发酵的TMR；新鲜青贮堆放在地面6 h配制TMR，为青贮已二次发酵的TMR。分别取TMR样品45 kg，平均分成5份，每份9 kg，生物饲料按0、50、100、200、300 g/kg的添加量添加至TMR中混匀，平均分成5份，共计10个处理组，50个样品。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.T001表1TMR日粮组成原料组成含量合计100.0玉米青贮50.6苜蓿草6.0燕麦草1.2压片玉米6.0甜菜颗粒粕2.4棉籽3.6奶牛精料补充料27.7糖蜜2.5%1.3测定指标及方法取各组TMR样品3 kg疏松放置于15 L敞口聚乙烯塑料桶，桶口使用双层纱布包裹，防止水分散失，将温度计插入TMR中间表面下10 cm处，记录TMR在有氧暴露过程中温度变化。温度每12 h记录一次，记录至48 h。试验结束采集样品，按照GB/T 13092—2006《饲料中霉菌总数的测定》测定霉菌总数。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 19.0软件分析，一般线性模型进行双因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵对饲料霉菌生长的影响生物饲料A由饲料经过菌种发酵而成。生物饲料B，与生物饲料A具有相同配方、未经发酵，试验前用蒸馏水调和，含水量与生物饲料A相同。发酵前后饲料霉菌生长情况见图1。生物饲料A与B在营养琼脂上培养5 d。由图1可知，生物饲料A表面未见有霉菌生长，生物饲料B表面可见大量霉菌生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.F001图1发酵前后饲料霉菌生长情况2.2生物饲料（青贮未二次发酵）添加量对TMR温度的影响（见表2、图2）由表2可知，试验开始，各组TMR的温度为24.5 ℃，室温为26 ℃。放置12 h，各组TMR温度比0 h时均极显著提高3~4 ℃（P0.01），但各处理组间差异不显著（P0.05）。放置24 h，对照组TMR温度提高至31 ℃，极显著高于12 h时的温度（P0.01）。添加生物饲料的TMR，24 h温度与12 h时基本一致（P0.05），说明未发生有氧变质，与对照组相比，添加生物饲料可显著降低TMR温度（P0.01），且添加量100、200和300 mg/kg的TMR温度极显著低于50 mg/kg（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.T002表2生物饲料（青贮未二次发酵）添加量对TMR温度的影响项目生物饲料添加量/(g/kg)SEMP值0501002003000 h24.50C24.50C24.50C24.50C24.50C——12 h28.30B27.80B27.70B27.70B27.60B0.190.1324 h31.30Aa29.00Bb27.80Bc27.40Bc27.00Bc0.130.0136 h32.70Aa32.30Aa31.80Aab30.50Abc29.20Ac0.470.0148 h32.70Aa32.00Aab31.30Abc30.80Ac30.70Ac0.330.01SEM0.290.280.350.290.14P值0.010.010.010.010.01注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。℃放置36 h，添加100、200和300 mg/kg生物饲料的各组TMR温度相似（P0.05），均极显著低于对照组（P0.01）。各组温度均高于室温（27 ℃），表明各组TMR均发生有氧变质。试验48 h，各组TMR温度与36 h时基本一致（P0.05），说明TMR在空气中暴露36 h，TMR内部微生物的生长基本达到稳定状态。由表2可知，添加100、200和300 mg/kg生物饲料组在24~48 h的温度差异不显著（P0.05），且均低于对照组（P0.05）。试验48 h，本试验选择对照组和100 mg/kg组，从TMR内部进行采样测定样品的霉菌总数。由图2可知，对照组的霉菌总数为250 CFU/g，100 g/kg组的霉菌总数为100 CFU/g，添加生物饲料的TMR在有氧条件下霉菌的生长数量比对照组低60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.F002图2生物饲料（青贮未二次发酵）对TMR霉菌总数的影响2.3生物饲料（青贮已二次发酵）对TMR温度的影响（见表3、图3）由表3可知，试验开始，各组TMR的温度约为24.0 ℃，低于室温（26 ℃）。放置12 h，生物饲料添加量为200和300 g/kg组TMR温度显著低于对照组、添加量50和100 g/kg组（P0.01）。放置24 h，各组温度均高于室温，且均极显著高于12 h时的温度（P0.01），表明各组TMR均发生有氧变质。但生物饲料添加量100、200和300 mg/kg的TMR温度极显著低于对照组和50 mg/kg组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.T003表3生物饲料（青贮已二次发酵）添加量对TMR温度的影响项目生物饲料添加量/(g/kg)SEMP值050 g/kg100 g/kg200 g/kg300 g/kg0 h23.70C24.00C24.00C24.00C24.20C0.100.2012 h31.10Ba31.10Ba29.60Ca27.70Cb27.80Cb0.420.0124 h44.50Aa41.60Aa36.30Bb34.00Bb34.30Bb0.790.0136 h48.20Aa47.20Aa44.10Ab43.00Ab42.70Ab0.410.0148 h48.70Aa46.00Ab42.70Ac42.20Ac42.00Ac0.200.01P值0.010.010.010.010.01SEM0.670.440.570.180.11℃放置36 h，生物饲料添加量100、200和300 mg/kg的TMR组内部温度相似（P0.05），均极显著低于对照组（P0.01）。试验48 h，各组TMR内部的温度与36 h时差异不显著（P0.05），说明TMR在空气中暴露36 h，TMR内部微生物的生长基本达到了稳定状态。由表3可知，生物饲料添加量100、200和300 mg/kg组在24~48 h的温度差异不显著（P0.05），且均低于对照组（P0.05）。本试验选择对照组和100 mg/kg组取样测定霉菌。由图3可知，对照组的霉菌总数为1 500 CFU/g，生物饲料添加量100 g/kg组的霉菌总数为400 CFU/g，添加生物饲料的TMR在有氧条件下霉菌的生长数量比对照组低73%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.018.F003图3生物饲料（青贮已二次发酵）对TMR霉菌总数的影响青贮未二次发酵和已二次发酵的TMR相比，放置48 h，青贮已二次发酵的TMR温度比青贮未二次发酵的TMR温度高约15 ℃（P0.05），霉菌数量高出5倍（P0.05）。说明含青贮二次发酵的TMR中霉菌更容易生长、温度更易提高，TMR稳定性更差。3讨论TMR有氧稳定性是TMR制成后暴露在空气中时的稳定程度。TMR在制作过程中为了提高日粮的适口性以及防止动物挑食行为的发生，TMR水分通常控制在50%，较高的水分含量在适宜的温度环境条件会导致TMR发生好氧变质。TMR好氧变质是一个微生物为主导的复杂生物化学过程，引起好氧变质的主要是好氧细菌、酵母和霉菌等[11]，其种类、数量和生理生化特性是影响TMR好氧变质的重要因素。生物饲料是以有益微生物为发酵菌种，以饲料原料为发酵底物，发酵产生有益菌种及其生物活性物质，其中包含小肽、寡糖、有机酸及酶等[12]。研究表明，生物饲料产品在替代抗生素方面具有积极作用[13-15]。生物饲料发酵产生的活性物质已被证实具有免疫调节、抗病毒及抗菌等功能[16-18]。本研究中，暴露在空气中相同时间条件下，添加有生物饲料会显著降低TMR日粮温度和霉菌生长，说明生物饲料能够改善TMR日粮有氧稳定性，抑制TMR中霉菌的生长，与生物饲料中含有丰富的有机酸有关。刘秦华等[19]研究发现，乳酸和pH值与有氧稳定性呈极显著负相关，与本试验结果一致。本研究中，青贮二次发酵的TMR组的温度变化规律与青贮未二次发酵组呈一致性。但青贮二次发酵的TMR组温度均高于相同时间点的青贮未二次发酵组。说明青贮二次发酵的TMR的有氧稳定性更差，原因是青贮二次发酵后含有大量的酵母菌，是好氧变质过程中最重要的微生物[20]。Beck等[21]研究发现，青贮饲料中的酵母数量高于105 CFU/g FM时更容易发生好氧变质。因此，当牧场使用的青贮已经存在二次发酵的情况时，添加该种青贮时TMR饲喂过程中的有氧稳定性会降低，极易发生好氧变质，造成日粮适口性和营养水平下降；若好氧变质过程较长，还会出现霉菌生长繁殖产生毒素，危害动物健康。牧场需要通过窖面管理和喷洒抑菌添加剂避免青贮二次发酵。4结论从TMR温度升高幅度和霉菌生长方面进行评定，已发生二次发酵的青贮更易破坏TMR有氧稳定性，TMR中添加100 mg/kg生物饲料可显著改善TMR有氧稳定性。