团头鲂(Megalobrama amblycephala )，俗称鳊鱼、草鳊等，属鲤形目鲤科鲌亚科鲂属，是我国淡水养殖的优良品种。团头鲂肉质鲜美、营养丰富，深受消费者的喜爱，市场前景广阔。但随着现代渔业集约化养殖发展，团头鲂养殖规模不断扩大，产生了养殖环境污染、抗生素滥用等问题[1]，严重影响了团头鲂的健康生长。中草药含有多种天然生物碱、有机酸等生物活性物质[1]。中草药能够提高动物机体的消化和吸收代谢率，促进动物的生长发育[2-5]，改善肌肉品质[6]，还能够刺激机体的免疫系统[7-10]，提升淡水鱼类的养殖品质和抗病力[11-14]。发展无公害养殖以及绿色水产品，中草药可作为免疫增强剂应用[10]。目前，关于中草药复方制剂对特定品种团头鲂的非特异性免疫机能及抗病力方面的研究报道较少。前期研究中选择金盏花、杜仲、黄芪组成复方制剂，探讨该中草药复方制剂对团头鲂的生长性能的影响[5]。本试验在前期试验的基础上，进一步分析中草药复方制剂对团头鲂非特异性免疫指标和抗病力的影响，为筛选对团头鲂具有良好免疫增强效果的中草药复方制剂、提升团头鲂免疫力和抗病力提供安全、高效的技术方案。1材料与方法1.1试验材料试验所用团头鲂初始体重为（50.0±1.8）g，购自海兴农苗种厂。试验期投喂的饵料在团头鲂全价饵料配方中分别添加2%和4%的不同的中草药复方制剂（A、B、C）。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T001表1基础饵料组成及营养水平项目A1组A2组B3组B4组C5组C6组D7组原料组成豆粕28.0026.0028.0026.0028.0026.0030.00菜籽粕25.0025.0025.0025.0025.0025.0025.00小麦20.0020.0020.0020.0020.0020.0020.00DDGS12.0012.0012.0012.0012.0012.0012.00统糠1.501.501.501.501.501.501.50米糠粕2.702.702.702.702.702.702.70大豆油2.002.002.002.002.002.002.00膨润土3.003.003.003.003.003.003.00磷酸二氢钙2.702.702.702.702.702.702.70氯化胆碱0.140.140.140.140.140.140.14食盐0.300.300.300.300.300.300.30矿物质预混料0.500.500.500.500.500.500.50抗氧化剂0.010.010.010.010.010.010.01防霉剂0.050.050.050.050.050.050.05多维预混料0.100.100.100.100.100.100.10中草药复方制剂A2.004.000.000.000.000.000.00中草药复方制剂B0.000.002.004.000.000.000.00中草药复方制剂C0.000.000.000.002.004.000.00合计100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白26.6025.7426.625.7426.625.7427.46粗脂肪2.002.002.002.002.002.002.00赖氨酸1.001.001.001.001.001.001.00粗纤维8.008.008.008.008.008.008.00粗灰分12.0012.0012.0012.0012.0012.0012.00钙4.004.004.004.004.004.004.00总磷0.500.500.500.500.500.500.50水分12.5012.5012.5012.5012.5012.5012.50注：1.预混料购自清远海贝生物技术有限公司。2.营养水平均为实测值。%中草药复方制剂A以金盏花微粉为主，杜仲和黄芪微粉为辅；中草药复方制剂B以杜仲微粉为主，金盏花和黄芪微粉为辅；中草药复方制剂C以黄芪微粉为主，金盏花和杜仲微粉为辅。金盏花、黄芪、杜仲均购自广州清平中药材批发市场。1.2试验设计1 500尾团头鲂放入大型养殖循环系统中，暂养7 d，暂养期间投喂团头鲂基础饵料。正式试验开始，随机挑选1 050尾（50.0±1.8）g的团头鲂，随机分到21个小型循环水试验系统中。21个小型循环水系统随机分成7组，编号分别为A1组、A2组、B3组、B4组、C5组、C6组、D7组（对照组），每组设3个重复，每重复50尾鱼，分别投喂对应编号的复方饲料。1.3饲养管理循环水水温为（18.0±1.5）℃，pH值7.2~7.6，试验过程溶氧量为8.3~8.6 mg/L。每日7：00、12：00和18：00定时投喂3次，日均投饵率为3%。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集试验正式开始后，每日观察记录团头鲂的摄食、发病及死亡情况。试验第7、14、21、28 d，各组取5尾团头鲂静脉采血，一份为肝素钠抗凝血测定白细胞吞噬指数；另一份为非抗凝血测定溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化氢酶（CAT）活性。1.4.2非特异性免疫相关酶的测定SOD、CAT、碱性磷酸酶（AKP）、LZM活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定，试验操作参见试剂盒说明书。1.4.3白细胞吞噬指数的测定取100 μL白细胞悬液，根据MTT染色法测定白细胞金黄色葡萄球菌悬液在520 nm处吸光值，判定白细胞吞噬金黄色葡萄球菌能力[15]。1.4.4嗜水气单胞菌攻毒侵染饲养试验结束后，各组分别随机挑选团头鲂20尾，腹腔注射嗜水气单胞菌悬液50 μL。注射完毕后，团头鲂继续放回养殖系统中观察1 w，记录各组1周内累计死亡率。嗜水气单胞菌分离自患病团头鲂肝脏组织。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1中草药复方制剂对团头鲂血清LZM活性的影响（见表2）由表2可知，试验第7 d，A2组团头鲂血清的LZM活性显著低于对照组（D7组）（P0.05）。试验第14 d时，B4组、C5组和C6组团头鲂血清的LZM活性显著高于其他组（P0.05）。第21、28 d时，C5组、C6组团头鲂血清的LZM活性均显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T002表2中草药复方制剂对团头鲂血清LZM活性的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组87.87±1.3390.41±0.80ab86.01±4.20b93.81±2.31b89.72±4.35cA2组88.49±0.0489.34±1.51b86.48±0.30b93.87±5.07b89.07±8.69cB3组87.52±0.8189.81±0.23ab89.06±3.58b95.68±3.49b90.47±3.96cB4组88.12±0.6190.48±0.51ab104.50±5.70a95.65±3.67b99.70±3.90bC5组87.92±1.1490.43±0.21ab109.38±5.20a112.08±1.59a110.11±2.74aC6组88.23±0.5890.51±0.14ab107.53±6.84a115.04±1.38a113.33±2.36aD7组87.81±1.0190.85±0.17a88.16±2.26b93.61±1.41b86.56±1.23c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3~表5与此同。U/L2.2中草药复方制剂对团头鲂血清SOD活性的影响（见表3）由表3可知，试验第21 d，C6组团头鲂血清的SOD活性最高，显著高于其他组（P0.05）；其次为C5组，显著高于对照组和A2组、B3组、B4组（P0.05）。试验第28 d，C6组团头鲂血清SOD活性最高，显著高于其他组（P0.05）；其次为C5组，显著高于对照组和A1组、A2组、B3组、B4组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T003表3中草药复方制剂对团头鲂血清SOD活性的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组88.89±1.1791.30±1.1890.14±3.9090.60±2.62bc89.82±3.82cA2组88.88±0.9091.56±0.7790.79±4.2989.32±5.17c89.13±5.14cB3组89.25±0.4691.60±1.0690.65±3.1988.23±2.61c89.41±3.41cB4组88.60±0.5091.70±0.9491.79±1.9787.61±2.62c88.61±0.38cC5组88.81±0.4291.40±1.0290.05±3.1895.87±2.65b101.88±3.62bC6组89.55±0.5291.10±1.0591.53±0.78124.07±4.45a119.74±3.79aD7组88.73±0.4890.98±0.9190.35±0.4986.70±1.20c86.56±1.55cU/L2.3中草药复方制剂对团头鲂血清CAT活性的影响（见表4）由表4可知，第7 d，C5组、C6组团头鲂血清CAT活性显著高于其他组（P0.05）。第14 d，各试验组团头鲂血清CAT活性均显著高于对照组（P0.05），C5组、C6组显著高于A1组、A2组、B3组、B4组和对照组（P0.05）。第21 d，A2组、C5组、C6组团头鲂血清CAT活性显著高于对照组和A1组、B3组、B4组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T004表4中草药复方制剂对团头鲂血清CAT活性的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组5.97±0.216.07±0.11b5.70±0.10b5.83±0.06c5.97±0.12A2组6.00±0.176.03±0.15b5.73±0.15b6.23±0.15a6.17±0.12B3组5.93±0.066.07±0.12b5.80±0.10b5.87±0.06bc6.07±0.12B4组6.00±0.105.93±0.06b5.90±0.10b5.87±0.06bc6.03±0.15C5组6.13±0.127.50±0.20a6.87±0.06a6.07±0.15ab6.13±0.25C6组6.00±0.107.40±0.20a6.73±0.15a6.13±0.06a6.17±0.06D7组6.10±0.105.97±0.15b5.50±0.10c5.83±0.15c5.93±0.56U/L2.4中草药复方制剂对团头鲂白细胞吞噬指数的影响（见表5）由表5可知，试验第7 d，C6组团头鲂的白细胞吞噬指数显著高于其他组（P0.05）。试验第14 d，C6组白细胞吞噬指数为0.38，显著高于对照组和B3组（P0.05）。试验第21 d，C6组的白细胞吞噬指数显著高于其他组（P0.05）。试验第28 d，C6组的白细胞吞噬指数显著高于对照组、B4组、C5组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T005表5中草药复方制剂对团头鲂血液白细胞吞噬指数的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组0.36±0.010.37±0.01b0.36±0.01ab0.35±0.01b0.38±0.01abA2组0.36±0.010.37±0.01b0.37±0.01ab0.35±0.01b0.39±0.04abB3组0.36±0.010.36±0.01b0.36±0.01b0.36±0.01b0.39±0.05abB4组0.36±0.010.36±0.01b0.37±0.03ab0.36±0.01b0.37±0.01bC5组0.36±0.010.36±0.09b0.36±0.01ab0.36±0.02b0.36±0.02bC6组0.36±0.010.41±0.01a0.38±0.01a0.43±0.01a0.42±0.01aD7组0.36±0.010.35±0.03b0.35±0.01b0.35±0.01b0.35±0.01b2.5中草药复方制剂对团头鲂抗病力的影响（见表6）由表6可知，C6组团头鲂的累计死亡率最低，为40.67%，显著低于其他组（P0.05）；C5组团头鲂的累计死亡率为45.33%，显著低于对照组和A1组、A2组、B3组、B4组（P0.05）。A1组、A2组、B3组团头鲂的累计死亡率与对照组差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.013.T006表6中草药复方制剂对团头鲂抗病力的影响项目A1组A2组B3组B4组C5组C6组D7组死亡率62.33±1.15a60.67±0.58a60.67±0.58a58.00±2.00b45.33±1.53c40.67±2.08d62.67±1.15a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%3讨论3.1中草药复方制剂对团头鲂免疫相关酶的影响鱼虾等水生生物主要依靠非特异免疫系统防御病害，而LZM、SOD、CAT等通常被认为是重要的免疫应答因子。LZM能够通过水解细菌细胞壁黏性多肽中的乙酰氨基多糖，使细菌因渗透压不平衡而破裂死亡[16]；SOD主要起防止生物分子损伤、清除超氧自由基等作用[17]；CAT能够消除生物体新陈代谢产生的有害物质，从而起抗氧化、防止羟自由基形成的作用[18]。邢玉娟等[19]研究发现，投喂由黄芪、甘草等组成的中草药复方制剂可提升草鱼组织中的LZM、SOD活性。梁拥军等[20]研究发现，在基础饵料中添加金银花可显著提高宝石鲈的相关免疫酶活性。本研究结果与上述研究报道一致，在团头鲂的基础饵料中添加中草药复方制剂，对鱼体血清中免疫相关酶的活性均有不同程度的影响。以黄芪为主的中草药复方制剂C5组和C6组的提升效果更明显，其中以4%添加量的C6组的影响最为显著。这一结果与前期的生长试验结果相吻合。本课题组前期研究中，添加中草药复方制剂A、B、C后均可在一定程度上提高团头鲂的生长性能[5]，原因可能是中草药复方制剂里的生物活性成分提升了鱼体免疫酶的活性，鱼体免疫机制得以增强，从而改善了鱼体生长性能。3.2中草药复方制剂对团头鲂免疫细胞的影响鱼类的吞噬细胞是非特异性防御系统的关键组成部分，具有清除大分子和递呈的作用。吞噬细胞还会被微生物的有害产物激活，受微生物干扰时产生更有效的抗微生物因子，参与炎症反应。李华等[21]以牛膝等多味中草药组成不同复方投喂大菱鲆，发现鱼体白细胞的氧呼吸爆发活性和吞噬活性得到明显提高。宋文华等[22]和盛竹梅等[23]研究发现，黄芪可提高免疫细胞的免疫功能。本研究中，以黄芪为主的复方制剂C6组连续投喂14~28 d后，团头鲂的白细胞吞噬指数升高，与上述研究结果相似。3.3中草药复方制剂对团头鲂抗病力的影响嗜水气单胞菌属弧菌科气单胞菌属[24]，是一种严重威胁健康养殖的人、兽、鱼共患的条件致病病原菌[25-26]，也是团头鲂的主要致病菌。嗜水气单胞菌能够产生胞外蛋白酶、多种外毒素（如肠毒素、溶血素、气溶素、和细胞毒素）和黏附因子等毒力因子，可导致水生生物血淋巴失去功能或组织器官被侵染，最终发生病变，甚至死亡[27]。研究发现，中草药对上述养殖常见的致病菌具有一定的抑制和杀灭作用[28]；多种中草药对嗜水气单胞菌具有体外抑制效果[29-31]。本研究中，采用嗜水气单胞菌对投喂中草药复方制剂的团头鲂进行腹腔攻毒试验发现，C组团头鲂的存活率显著高于对照组和中草药复方制剂A组、B组，说明以黄芪为主、金盏花和杜仲为辅的中草药复方制剂C对嗜水气单胞菌具有体外抑制效果，能够有效提升团头鲂的抗病力。该结果也从另一方面解释了前期试验研究中，中草药复方制剂C组团头鲂的生长效果明显优于其他组的原因[5]。4结论团头鲂基础饵料中添加2%和4%的中草药复方制剂C（以黄芪微粉为主，金盏花和杜仲微粉为辅）能够有效增强团头鲂的非特异性免疫机能，提升鱼体抗病力，其中以4%的添加量效果更佳。