我国苹果大部分直接加工为果汁饮品，果渣产出量不断增加。目前，仅有25%~30%的苹果渣用于肥料和饲料等用途，其余因无法有效利用而废弃。有研究发现，苹果渣是一种低蛋白饲料原料，其蛋白质含量仅为3%~5%[1]。为提高苹果渣利用率，研究者通过生物发酵技术将苹果渣转化为高蛋白饲料应用于动物生产中[2-9]。本研究通过比较筛选较优菌种，为提高发酵苹果渣中蛋白质含量和苹果渣蛋白饲料发酵技术提供参考。1材料与方法1.1试验材料鲜苹果购自平凉市阳光果蔬菜批发市场，清洗压榨，果渣测得pH值5.0，含水量80%以上；60~65 ℃干燥，粉碎，过40目筛，室温保存。白地霉（编号：GSICC50701）、绿色木霉（编号：GSICC62010）均购自甘肃省科学院生物研究所；米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母均购自甘肃农业大学食品科学与工程学院；根霉菌购自安琪酵母股份有限公司；麦芽汁培养基购自青岛海博生物技术有限公司。1.2培养基制备马铃薯蔗糖培养基：马铃薯20 g（煮沸20 min过滤）、蔗糖2 g、酵母粉0.5 g，加水补至100 mL，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。固体苹果渣发酵培养基：干苹果渣为主要基质，料水比10∶8 g/mL，添加一定浓度碳氮源及辅料，用于菌种筛选。1.3试验设计白地霉（简称：白）、啤酒酵母（简称：啤）、根霉菌（简称：根）、枯草芽孢杆菌（简称：枯）和绿色木霉（简称：绿）分别接种于不同含量苹果渣培养基上，根据各菌种生长态势和苹果渣用量，确定苹果渣在培养基中含量；以白地霉为指示菌，其他4株基础菌为主进行平板点种刺激圈试验，观察基础菌生长情况，进行2组合和5组合配比试验，以不发酵的苹果渣为对照，以苹果渣蛋白质含量确定复合菌种配比。1.4测定指标及方法1.4.1粗蛋白测定粗蛋白测定采用白凤翎[10]改进的双缩脲法和半微量凯氏定氮法（GB/T 14771—1993）。1.4.2菌种活化引进的冻干菌种外表消毒，打开安瓿，加入培养液消融，移植于适宜的斜面培养基，31 ℃培养24~72 h。1.4.3菌种在不同含量的苹果渣培养基上生长试验不同菌种分别划线接种于不同含量的苹果渣琼脂平板，31 ℃培养24~72 h，观察苹果渣琼脂平板上各株菌的生长情况，确定苹果渣培养基含量。1.4.4菌种的平板点种试验斜面上保存的菌种分别划线接种于6%苹果渣琼脂平板，31 ℃培养72 h，观察各株生长情况。1.4.5菌种的平板点种刺激圈试验利用微生物共生原理，进行平板点种刺激圈试验。白地霉斜面菌种以少量灭菌水洗，接入灭菌的6%苹果渣琼脂平板，分别点种待选菌，31 ℃培养72 h，观察固体平板点种各菌株处白地霉的生长情况。1.4.6单菌种的发酵试验将5株菌分别接种于6%苹果渣培养基，发酵72 h，65 ℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。1.4.7两菌种的混合比试验5株菌以2株为1组合，按不同比例分别接种6%苹果渣培养基，发酵72 h，65 ℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。1.4.85菌种的混合比试验5菌株按不同菌种的比例分别接种于6%苹果渣培养基，发酵72 h，65 ℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。1.4.9苹果渣发酵蛋白饲料的最佳菌种组合接种量筛选确定的苹果渣发酵蛋白饲料的最佳组合菌种分别接种于麦芽汁液体培养基，培养16~20 h，作为基础种子；将最佳组合菌种按比例接种于干苹果渣培养基（料液比为10∶8 g/mL）中，31 ℃培养48 h，作为一级种子；将一级种子按不同的比例接种于灭菌的新鲜苹果渣中，31 ℃培养72 h，65 ℃烘干发酵的苹果渣；设未发酵的同批新鲜苹果渣65 ℃烘干的产物。采用双缩脲法测定其发酵前后苹果渣的蛋白质含量。2结果与分析2.1菌种的平板点种试验（见表1）由表1可知，将分别保存于斜面上的白地霉、酵母、根霉菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉分别接种于不同含量的灭菌苹果渣上，均能够在4%以上的苹果渣中形成大小不同的菌圈，且生长良好。从各菌种在不同含量的苹果渣的平板上生长态势和苹果渣的用量综合分析，最终选用6%苹果渣含量培养基作为菌种筛选培养基。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T001表1菌种在不同含量的苹果渣培养基上生长情况菌种苹果渣用量/%2468白地霉+++++++++啤酒酵母-++++根霉菌+++++++++枯草芽孢杆菌++++++绿色木霉+++++++++注：“-”、“+”、“++”及“+++”分别表示培养物外观无明显变化、菌体开始生长、菌体明显可见及菌体生长良好；下表同。2.2平板点种刺激圈试验（见表2）由表2可知，啤酒酵母、根霉菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉均可明显刺激白地霉生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T002表2不同菌株在6%苹果渣培养基上对白地霉刺激生长作用菌种结果啤酒酵母+++根霉菌+++枯草芽孢杆菌+++绿色木霉++2.3菌种发酵筛选试验2.3.1单菌种发酵试验结果（见表3）由表3可知，7株菌分别接种于6%苹果渣培养基，发酵后干燥样品的蛋白质含量均在10 mg/g以上，且白地霉含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T003表3单菌种发酵试验结果项目干燥样品的蛋白质含量对照组5.342啤酒酵母10.487根霉菌11.943枯草芽孢杆菌11.450绿色木霉10.776白地霉12.318mg/g2.3.2两菌种发酵试验结果（见表4）由表4可知，啤酒酵母+枯草芽孢杆菌（1.0∶0.5）组合发酵苹果渣蛋白质含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T004表4两菌种组合的分种混合比试验结果项目不同分种比发酵后干燥样品的蛋白质含量1.0∶0.51.0∶1.01.0∶2.02.0∶1.0对照组7.124白∶绿8.9818.98111.5599.848白∶啤8.7648.98110.3309.366白∶根11.96912.16111.96913.318白∶枯12.64313.89612.45010.427绿∶啤9.5599.9457.5358.619绿∶根9.5598.5959.5599.366绿∶枯9.5598.9819.4637.780啤∶根12.37812.16111.1989.560啤∶枯13.8608.98110.61913.414根∶枯10.42711.48711.19812.547mg/g2.3.35菌种发酵试验结果（见表5）由表5可知，不同比例菌种组合发酵后干燥样品蛋白质含量均在12 mg/g以上，以白地霉+啤酒酵母+根霉菌+枯草芽孢杆菌+绿色木霉（2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶1.0）组合发酵后干燥样品蛋白质含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T005表55菌种组合的分种混合比试验结果项目分种比发酵后干燥样品的蛋白质含量/(mg/g)对照组—7.985白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶1.0∶1.0∶1.012.932白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶0.513.125白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶1.0∶1.0∶0.512.065白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶1.0∶0.5∶1.012.836白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶0.5∶1.0∶0.512.450白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶0.5∶1.0∶1.013.029白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶1.0∶0.5∶0.513.125白∶酵∶根∶枯∶绿2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶1.015.149白∶酵∶根∶枯∶绿1.0∶0.5∶0.5∶1.0∶0.212.607白∶酵∶根∶枯∶绿1.0∶0.5∶0.5∶1.0∶0.112.3542.3.4最佳菌种组合接种量的筛选（见表6）由表6可知，菌种按15%的比例接种于灭菌的新鲜苹果渣，其产物蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.020.T006表6最佳菌种组合接种量的筛选试验结果组别菌种组合不同接种量发酵后干燥样品的蛋白质含量1%2%5%10%15%20%试验组白∶酵∶根∶枯∶绿（2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶1.0）7.6687.9248.2749.88010.5359.435对照组—6.244mg/g3讨论3.1菌种对发酵结果的影响苹果渣发酵多采用单菌种、两菌种、3菌种和4菌种发酵技术，混合菌种发酵主要是利用菌种间协调互作关系，多采用黑曲霉作为基础菌进行发酵。徐抗震等[11]利用产朊假丝酵母、果酒酵母及绿色木霉发酵苹果渣，使苹果渣蛋白质含量提高至28.43%。高再兴等[12]经土壤分离纯化筛选出产朊假丝酵母和黑曲霉进行组合发酵，蛋白质含量明显提高。王代强[13]利用黑曲霉和产朊假丝酵母发酵苹果渣，结果发现，双菌种发酵效果明显好于单菌种发酵，粗蛋白含量增加了35.19%。本试验前期预试验发现，黑曲霉容易产生黑色孢子，故以白地霉作为基础菌进行组合发酵，结果表明，混合菌种发酵优于单菌种发酵，表现出多菌种间相互补偿协调发酵的作用。3.2混合比对发酵结果的影响发酵苹果渣常用混合菌种，菌种间的接种比例对发酵产物的品质是至关重要的。徐抗震等[11]按照产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母按4.5∶3.0∶1.0比例发酵苹果渣，测定发酵产物中的蛋白质含量明显高于其他比例。原料中还原糖含量比较高，酵母起主要作用。罗雯[14]将白地霉与绿色木霉分别按照1∶1、1∶2、l∶4、1∶10、1∶20的比例发酵苹果渣，结果发现，当比例为1∶10时，发酵产品粗蛋白质增幅最高，且不产生绿丝孢子，发酵产品质得到明显改善。陈松等[15]通过试验获得了苹果渣发酵产高蛋白的最优菌种组合，即发酵比例为产朊假丝酵母∶白地霉∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉=0.5∶1.0∶1.0时为最优接种比例，发酵生成的粗蛋白含量为15.32%，比未发酵提高了108%。罗文等[16]以酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉为发酵菌株对豆渣、苹果渣进行发酵。结果表明，酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的配比为3∶2∶4时，发酵产物中粗蛋白质的质量分数从15.87%提高至19.83%。本研究以白地霉∶啤酒酵母∶根霉菌∶枯草芽孢杆菌∶绿色木霉=2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶1.0比例接种时，发酵后的蛋白质含量为15.149 mg/g，比对照组7.985 mg/g提高了89.7%，与上述研究结果相似。3.3菌种接种量对发酵结果的影响接种量对培养周期和菌株产酶均具有较大影响。接种量过小，菌体繁殖缓慢，培养时间长，发酵周期延长；接种量过大，菌体繁殖过快，产生过多的代谢废物。接种量适宜，既可有效缩短培养周期，能够得到较高的菌体生物量，获得较多的酶，提高发酵产物的品质和蛋白质含量。因此，发酵过程中应确定适当的接种量。因选择的菌种不同，所需接种量也不相同。从规模化生产角度考虑，在允许的范围内应尽可能降低接种量，减少成本。宋纪蓉等[17]采用果酒酵母与康宁木霉的激光选育种对苹果渣进行发酵，结果表明，接种量为3%~10%时，粗蛋白质含量随接种量的增加显著提高；超过10%时，变化趋于平缓。秦蓉[18]将白地霉、热带假丝酵母和康氏木霉按2∶2∶1的比例分别按2%、5%、10%、15%和20%的接种量接入苹果渣固体发酵培养基进行固体发酵试验，结果表明，接种量为5%~10%时，发酵产物的蛋白质含量最高。朱新强等[19]利用酿酒酵母菌和植物乳酸杆菌为发酵菌种，按照2.5%、5.0%、7.5%接种量葡萄渣、苹果渣和豆渣组合进行发酵，结果显示，产物粗蛋白质含量为11.25%，达到蛋白饲料评定标准。黄斐等[20]在苹果渣中添加2%绿色木霉、白地霉、黑曲霉组合物进行发酵，可产出较高含量粗蛋白质。本研究对最佳发酵菌种组合按照1%、2%、5%、10%、15%、20%的接种量进行不同量接种苹果渣试验，结果表明，15%接种量发酵苹果渣粗蛋白含量最高。4结论本试验表明，新鲜苹果渣中按照15%接种量接种白地霉∶啤酒酵母∶根霉菌∶枯草芽孢杆菌∶绿色木霉=2.0∶2.0∶0.5∶0.5∶1.0时，发酵后的蛋白质含量为10.535 mg/g，比对照组提高了68.7%。