芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，可产生内生芽孢，具有抗逆性强、耐高温、高压、易储存等生物学特性。枯草芽孢杆菌（BS）属于芽孢杆菌属，在肠道内增殖可消耗肠道内的氧，抑制有害菌的生长，促进有益菌的生长，可产生酶类、细菌素等多种代谢产物[1]。在动物养殖中应用芽孢杆菌可以提高动物的生长性能，改善肠道菌群结构，增强免疫力，净化养殖环境[2-5]。我国农业农村部发布的行业标准NY/T 2131—2012[6]对枯草芽孢杆菌产品具有明确的规定要求，但枯草芽孢杆菌因菌种来源、生产工艺及品质不同，造成使用效果等方面存在差异。因此，筛选出质优、价廉的枯草芽孢杆菌是目前研究的重点。本试验选用6个不同的枯草芽孢杆菌，进行体外抗逆性及抑菌性研究，为筛选出质优、价廉的枯草芽孢杆菌产品提供参考。1材料与方法1.1试验材料大肠埃希氏菌（ATCC25922）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）购自广东环凯生物科技有限公司。产气荚膜梭菌毒素A型（BNCC125404）购自北纳创联生物科技有限公司。6个不同的枯草芽孢杆菌由北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司分离筛选并制备成冻干粉保藏，分别记为BS-1、BS-2、BS-3、BS-4、BS-5、BS-6。胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Biofroxx-赛国生物科技有限公司；猪胆盐购自上海国药集团化学试剂有限公司。培养基：营养琼脂、营养肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1耐温试验将90 mL、0.9%生理盐水稀释液分装至250 mL试剂瓶，121 ℃灭菌30 min，冷却，称取10 g不同芽孢杆菌于稀释液中，75、80、85 ℃水浴锅中处理5、7.5、10 min，置于冷水中冷却。冷却结束进行梯度稀释，选择2~3个适宜稀释度，取1 mL稀释液至培养皿中，及时将营养琼脂（灭菌冷却至45~55 ℃）培养基倾注于培养皿中，旋转平板至充分摇匀，待琼脂凝固后37 ℃培养24 h，计算存活率。存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100%(1)1.2.2耐酸碱试验将90 mL、0.9 %生理盐水稀释液分装至250 mL试剂瓶，使用1 mol/L的HCl和NaOH溶液将稀释液的pH值调至2、3、4、5、6、7、8、9，空白对照组pH值为6.8。稀释液高压灭菌30 min，称取枯草芽孢杆菌10 g至各pH值的试剂瓶，37 ℃水浴处理2 h。处理结束后进行梯度稀释，选择2~3个适宜稀释度，取1 mL稀释液至培养皿中，及时将营养琼脂（灭菌冷却至45~55 ℃）培养基倾注于培养皿中，旋转平板至充分摇匀，待琼脂凝固后37 ℃培养24 h，计算存活率。1.2.3耐胃液试验参照贾丽艳[7]和刘秀侠[8]方法，分别取pH值为2.5、3.0、3.5的盐酸溶液100 mL于三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却至50 ℃以下，加入1 %的胃蛋白酶，混匀。称取枯草芽孢杆菌10 g于不同pH值的90 mL胃液中，37 ℃处理4 h，处理结束后进行梯度稀释，选择2~3个适宜稀释度，取1 mL稀释液至培养皿中，及时将营养琼脂（灭菌冷却至45~55 ℃）培养基倾注于培养皿中，旋转平板至充分摇匀，待琼脂凝固，37 ℃培养24 h，计算存活率。1.2.4耐肠液试验参照贾丽艳[7]和刘秀侠[8]方法，取100 mL、0.68% KH2PO4溶液，121 ℃灭菌20 min，冷却至30 ℃，加入1%胰蛋白酶，混匀。称取枯草芽孢杆菌10 g于90 mL肠液中，37 ℃处理4 h，处理结束进行梯度稀释，选择2~3个适宜稀释度，取1 mL稀释液至培养皿中，及时将营养琼脂（灭菌冷却至45~55 ℃）培养基倾注于培养皿中，旋转平板至充分摇匀，待琼脂凝固后37 ℃培养24 h，计算存活率。1.2.5耐胆盐试验取不同枯草芽孢杆菌10 g分别加入至含有0、0.3%猪胆盐溶液90 mL中，混匀，37 ℃水浴处理4 h，处理结束进行梯度稀释，选择2~3个适宜稀释度，取1 mL稀释液至培养皿中，及时将营养琼脂（灭菌冷却至45~55 ℃）培养基倾注于培养皿中，旋转平板至充分摇匀，待琼脂凝固，37 ℃培养24 h，计算存活率。1.2.6对致病菌的抑制试验参照刘冬梅等[9]牛津杯扩散法。取灭菌营养琼脂，温度降至50 ℃左右时倒平板，每个平皿约15 mL。待琼脂凝固，将牛津杯置于营养琼脂平板中，每个平板放置4个牛津杯。分别取大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌0.1 mL（108 CFU/mL）加至已灭菌100 mL的营养琼脂中（冷却至约50 ℃），摇匀。待琼脂凝固，取出牛津杯，标记为孔1、孔2、孔3、孔4。枯草芽孢杆菌产品使用生理盐水稀释10倍。孔1中加入灭菌生理盐水100 μL为对照组，将不同枯草芽孢杆菌稀释液100 μL加入孔2、孔3、孔4中，3个重复，4 ℃放置1 h，置于37 ℃培养24 h。使用游标卡尺量抑菌圈大小。2结果与分析2.1不同枯草芽孢杆菌对高温的耐受性（见表1）由表1可知，随处理温度的升高及处理时间的延长，枯草芽孢杆菌的活菌数量均呈下降趋势。不同枯草芽孢杆菌对同一温度的耐受性不同。85 ℃时，BS-5对高温的耐受性最好，处理10 min，存活率高达72.75%；BS-1对高温的耐受性最差，处理10 min，存活率仅为12.36%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.019.T001表1不同枯草芽孢杆菌热处理后的耐受性项目温度/℃存活率/%5 min7.5 min10 minBS-17571.5364.9353.408054.5846.0430.768548.6129.8612.36BS-27591.2482.9971.138081.9674.7453.878577.3263.4047.68BS-37590.7683.5373.498087.9575.9059.848577.5161.0451.81BS-47598.3776.0146.368074.5049.7534.558552.8931.6619.72BS-57595.0090.0083.338093.3382.1778.588582.5876.7572.75BS-67582.2772.9157.648075.3766.5054.688559.6154.1938.422.2不同枯草芽孢杆菌对pH值的耐受性（见表2）由表2可知，pH值2~7范围，随pH值降低，枯草芽孢杆菌的存活率呈下降趋势。pH值为7~9，随pH值增加，存活率呈下降趋势，但同种枯草芽孢杆菌的耐碱性优于耐酸性。所有枯草芽孢杆菌pH值为7时，存活率最大，pH值为2时，存活率最小。BS-5对不同pH值耐受性最好，pH值为2，BS-5的存活率为84.17%，pH值为9时，存活率为90.00%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.019.T002表2不同枯草芽孢杆菌对pH值的耐受性项目pH值23456789BS-144.0365.1472.2284.7292.3693.0684.7281.25BS-241.2453.0959.0266.2467.5369.8567.5368.30BS-369.3571.9873.9980.5384.3096.7388.3287.81BS-473.4977.5179.9281.5389.1695.5893.1788.35BS-584.1789.1790.8392.5095.0096.6795.8390.00BS-636.7052.7156.6559.6167.9870.9469.4669.46%2.3不同枯草芽孢杆菌在体外模拟胃肠道环境中的耐受性（见表3）由表3可知，不同枯草芽孢杆菌在体外条件下，对胃液、肠液及胆盐的耐受能力各不相同。pH值为2.5、3.0、3.5的胃液条件下处理4 h，BS-5的存活率分别为89.17%、95.00%、95.83%，是耐受胃液最好的芽孢杆菌。BS-5经肠液处理4 h后，耐受性最好，存活率为73.08%。BS-3在0.3%胆盐条件下处理4 h，存活率最高，为68.84%，BS-5的存活率为65.25%，BS-1的存活率最差，为24.86%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.019.T003表3不同枯草芽孢杆菌在体外模拟胃肠道环境中的耐受性项目胃液pH值肠液0.3%胆盐2.53.03.5BS-144.1048.4065.3544.1724.86BS-243.8165.9868.8143.8140.98BS-388.6993.2294.2224.1268.84BS-473.9086.7588.3521.0435.38BS-589.1795.0095.8373.0865.25BS-641.7742.8656.1634.7351.23%2.4不枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用（见表4）由表4可知，不同枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用不同。BS-1和BS-5对大肠埃希氏菌有抑制作用，BS-1抑菌效果优于BS-5。BS-1、BS-4和BS-6对产气荚膜梭菌均有抑制作用，抑菌强弱顺序为BS-1BS-6BS-4。所有枯草芽孢杆菌对鼠伤寒沙门氏菌均无抑制作用。因此，BS-1的抑菌效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.019.T004表4不同枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用项目浓度/(mg/L)抑菌圈直径/mm大肠埃希氏菌鼠伤寒沙门氏菌产气荚膜梭菌BS-1100 00010.47—13.45BS-2100 000———BS-3100 000———BS-4100 000——8.89BS-5100 0009.16——BS-6100 000——10.29注：牛津杯直径为8 mm，“—”表示无抑菌圈。3讨论饲用益生菌发挥益生作用，要有一定的活菌数量，益生菌进入动物胃肠道时，能够耐受胃部的酸性条件及肠道的微碱性、胆盐环境，在体内可抑制病原菌生长；饲料生产加工过程中，能够耐受高温膨化制粒环境[10-11]。使用耐酸、耐碱、耐胆盐、体外抗菌性、肠道黏附性、耐高温等指标作为饲用益生菌体外评价或筛选的方法。常见枯草芽孢杆菌的体外评价多数集中在对筛选菌种的评估，对质量评价未见报道。3.1枯草芽孢杆菌对温度的耐受性制粒是饲料高温高压加工制备颗粒饲料的工序之一，制粒过程的高温调质会影响益生菌的存活率。因此，高温耐受性作为筛选益生菌株的评价指标。颗粒饲料制粒的温度为70~90 ℃，蒸汽调质时间为30 s~2 min[12]。不同微生物菌种对高温耐受能力不同，导致存活率存在不同，如革兰氏阳性菌高温耐受能力优于阴性菌，芽孢杆菌高温耐受能力优于产阮假丝酵母菌、德氏乳杆菌和粪肠球菌[13]。本试验中，随处理温度的升高或处理时间的延长，枯草芽孢杆菌的活菌数量均呈下降趋势，与巴翠玉等[14]研究结论一致；相同时间内，枯草芽孢杆菌的存活率随温度的升高而不断下降。研究表明，芽孢衣对多价阳离子和水分的通透性很差，皮层的离子强度很高，能够产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，造成皮层充分膨胀，核心部分的细胞质却变得高度失水，因此具有较强的耐热性[15]。3.2枯草芽孢杆菌对不同pH值、胃液、肠液及胆盐的耐受性人和动物进食时胃液pH值在1.8~5.0，胃中消化时间一般为1~2 h；小肠胰液为碱性液体，pH值为7.8~8.4，小肠消化时间约为1.5 h[16-17]。益生菌耐酸碱性试验目前尚无统一标准。陈曦等[18]研究表明，枯草芽孢杆菌在酸性条件（pH值为5、4、3、2）下处理相同时间，随pH值降低，存活率明显下降，本试验结果与上述研究结果基本一致，pH值2~7范围内，随pH值降低，存活率呈下降趋势。张亚茹等[19]研究枯草芽孢杆菌N2-10在pH值2、3、4胃酸环境下处理3 h，存活率分别为80.2%、81.7%、87.9%，经人工肠液处理4 h后，存活率为36.1%。本试验中，BS-5经胃液处理4 h后存活率为89.17%~95.83%，经肠液处理4 h后存活率为73.08%，此结果优于张亚茹试验结果。胆盐主要通过降解细菌细胞壁中的脂肪使细菌失去活性，具有一定的抗菌性。人体和动物十二指肠内胆盐含量为0.03%~0.30%，0.3%胆盐浓度是目前筛选抗性菌株常用浓度[20]。本试验BS-3在0.3%猪胆盐条件下处理4 h，存活率为68.84%，具有较好的胆盐耐受性。不同枯草芽孢杆菌抗逆性不同，与枯草芽孢杆菌的种属特异性有关。枯草芽孢杆菌抗逆性较好，与其内生芽孢有关。芽孢外覆盖由蛋白质、脂类等组成的外壳（又称胞外壁），胞外壁内侧由多层蛋白组成的芽孢衣，芽孢衣非常致密，无透性，使芽孢杆菌具有较好的抗逆性[21]。3.3枯草芽孢杆菌对致病菌的抑制作用抑菌性是益生菌体外评价的重要指标。研究表明，枯草芽孢杆菌具有较好的体外抑菌作用。辛国芹等[22]研究发现，枯草芽孢杆菌BL-Y9对猪大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌CV33533、鸡大肠杆菌O78和金黄色葡萄球菌C56011有较好的体外抑菌效果。枯草芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌的抑菌直径达16.67 mm[23]。枯草芽孢杆菌抑菌原理主要是通过产生代谢产物来发挥抑制。翟召静[24]提取枯草芽孢杆菌的代谢物，蛋白质组学分析发现，10个差异上调蛋白中，大部分有降解RNA、抑制蛋白表达的功能，特别是mRNA干扰酶，可以引起细胞凋亡。李红红[25]在排除有机酸、H2O2等干扰物质后，枯草芽孢杆菌LF-9和LF-11对单增李斯特菌ATCC19114及藤黄微球菌两株致病菌具有较强的抑制作用，结果发现，发挥抑菌的活性物质为细菌素。枯草芽孢杆菌与致病菌竞争营养空间能够实现对病原菌的抑制作用。本试验结果显示，不同枯草芽孢杆菌的抑菌性不同，与屈平平[26]和周淑贞等[27]研究结果相似，2株枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌均的抑制程度存在差异，造成结果不同的主要原因是不同芽孢杆菌制剂产生的抑菌物质在数量和剂量上存在差异。本试验在同一试验条件下，研究对同一株质控菌的影响，不同芽孢杆菌抑菌结果差异的原因是菌株的种属特异性。4结论不枯草芽孢杆菌的体外抗逆性和抑菌性各不相同。BS-5对高温、pH值、胃液及肠液的耐受性最好；BS-3对胆盐的耐受性最好，BS-1体外抑菌效果最好。