我国中药渣产出量逐年增长，大部分药渣中仍含有30%~70%具有药效的活性物质未得到完全利用[1-5]。如何有效利用药渣资源，避免环境污染和资源浪费是需要解决的问题。黄芩含有多种黄酮类活性物质，抗炎症作用明显，对多种细菌、病毒均具有抑制作用。黄芩药用制备过程中，因现有提取方法的制约，黄芩药渣中含有大量氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、多糖、黄酮等功能活性物质，特别是含量丰富的残余黄芩苷[6-8]。益生菌发酵中药渣代替抗生素制备饲料添加剂具有巨大的潜在价值。刘磊[9]通过正交试验研究复合菌剂对复配中药药渣的发酵工艺优化，确定了最佳发酵工艺条件，提高了药渣中活性物质含量。尹丽等[10]利用响应面法优化了岗松药渣中葡萄糖的发酵工艺，使葡萄糖产量提高了10.7%。岳鹍等[11]对大黄药渣固体培养基组成和发酵条件进行了优化，提高了其发酵生产漆酶的活力。但关于微生物发酵黄芩药渣的研究较少。本研究以黄芩药渣为研究对象，利用植物乳杆菌发酵黄芩药渣，采用响应面法对药渣含水量、初始pH值、发酵温度、发酵时间、接种量进行优化，以提高发酵药渣中乳酸菌的有效活菌数量，改善发酵药渣的适口性，改善动物的肠道健康，为其作为饲料添加剂的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株植物乳杆菌L20201（Lactobacillus plantarum）由黑龙江省科学院微生物研究所保存；黄芩废渣为药厂生产过程中所产生废渣，药渣经低温烘干粉碎，过20目筛网。1.1.2培养基MRS培养基：牛肉膏10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.28 g/L、吐温80 1.0 g/L，pH值6.2~6.4。1.2试验方法1.2.1制备乳酸菌发酵液将保存的植物乳杆菌菌种L20201转接至MRS平板进行活化，纯化后转接入液体MRS培养基中，37 ℃静置发酵36~48 h，发酵液中植物乳杆菌数量≥108 CFU/mL。1.2.2发酵黄芩药渣单因素试验粉碎后的药渣加水配成相应含水量，搅拌均匀，120 ℃灭菌30 min，待药渣粉降温至27~40 ℃，接入植物乳杆菌菌液，于密闭发酵罐中厌氧发酵24~72 h。以发酵黄芩药渣中乳酸菌活菌数量为参考指标，研究药渣含水量、初始pH值、发酵温度、发酵时间及接种量对其影响，确定上述因素的最佳值。黄芩药渣的发酵条件中固定参数为：含水量60%、初始pH值6.00、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h、接种量1.0%，其余因素变化水平分别为：药渣含水量40%、50%、60%、70%、80%，初始pH值5.75、6.00、6.25、6.50、6.75，发酵温度27、30、33、37、40 ℃，发酵时间24、36、48、60、72 h，接种量0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%。1.2.3发酵黄芩药渣中乳酸菌有效活菌数量的测定发酵黄芩药渣中乳酸菌有效活菌数的测定方法采用稀释平板法，具体操作参照国家标准NY/T 2321—2013。称取发酵药渣10 g，加至含玻璃珠的100 mL无菌水中，静置20 min，充分振荡30 min制成菌悬液，依次对菌悬液进行10倍稀释，涂布于MRS平板，每组试验设2个平行，进行3次重复。1.2.4Plackett-Burman试验设计采用Plackett-Burman设计试验对黄芩药渣发酵条件中药渣含水量（A）、初始pH值（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）、接种量（E）5个影响因素进行分析。Plackett-Burman设计因素水平见表1。每个因素选取高（+1）、低（－1）两个水平，进行12个试验组合，每组进行3次重复，以发酵黄芩药渣中乳酸菌数量为考察指标，确定黄芩药渣发酵条件中显著影响因素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T001表1Plackett-Burman设计因素水平因素水平A含水量/%B初始pH值C发酵温度/℃D发酵时间/hE接种量/%-1506.0030481+1706.50377221.2.5Box-Behnken试验设计利用Design Expert 8.0.6软件中Box-Behnken建立3因素3水平的响应面模型，Box-Behnken因素水平设计见表2。以发酵黄芩药渣中乳酸菌数量为响应值，进行17个试验组合，每组进行3次重复，对黄芩药渣的发酵条件进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T002表2Box-Behnken因素水平设计因素水平A含水量/%B初始pH值C发酵温度/℃-1506.00300606.2533+1706.50371.3数据统计与分析数据采用Excel软件前处理，SPSS 19.0统计分析，Design Expert 12.0对数据进行拟合分析及绘图。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1含水量对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响（见图1）由图1可知，随着药渣含水量增加，发酵药渣中乳酸菌数量显著增加，当含水量达到60%时，乳酸菌数达到最高。随着药渣含水量继续增加，乳酸菌数量逐渐下降。因此，药渣含水量50%~70%为适宜水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F001图1含水量对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响2.1.2初始pH值对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响（见图2）由图2可知，发酵药渣中乳酸菌数随pH值变化较为明显。当pH值为5.75时，乳酸菌数量较少，随着pH值增大，乳酸菌数量先增多后减少。当pH值为6.25时，乳酸菌数量最多。因此，药渣发酵初始pH值控制在6.00~6.50之间较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F002图2初始pH值对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响2.1.3发酵温度对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响（见图3）由图3可知，随着发酵温度升高，乳酸菌数量逐渐增多，当温度达到33 ℃后，乳酸菌数量呈缓慢下降趋势，当温度超过37 ℃后，乳酸菌数量急剧下降。因此，发酵温度控制在30~37 ℃较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F003图3发酵温度对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响2.1.4发酵时间对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响（见图4）由图4可知，随着发酵时间延长，发酵药渣中乳酸菌数缓慢升高，发酵60 h后乳酸菌数量基本趋于平稳。因此，发酵时间控制在48~72 h之间较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F004图4发酵时间对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响2.1.5接种量对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响（见图5）由图5可知，随着乳酸菌接种量加大，发酵药渣中乳酸菌数量处于缓慢上升趋势。当接种量由0.5%升高至2.0%时，乳酸菌数量达到最高，随后基本趋于平稳。因此，接种量控制在1.0%~2.0%之间较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F005图5接种量对发酵药渣中乳酸菌活菌数量的影响2.2Plackett-Burman试验设计及显著影响因素的确定基于单因素试验结果，利用Plackett-Burman试验对黄芩药渣发酵条件中药渣含水量、初始pH值、发酵温度、发酵时间、接种量5个影响因素进一步分析，Plackett-Burman试验结果见表3。回归模型方差分析见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T003表3Plackett-Burman试验结果序号ABCDE有效活菌数/(×108 CFU/g)1-1111-17.62211-1117.823111-1-17.734-1-1-1-1-15.885-11-1116.486-111-117.33711-1-1-17.008-1-11-116.229-1-1-11-15.97101-1-1-116.82111-11117.50121-111-17.1410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T004表4回归模型的方差分析方差来源自由度平方和均方F值P值显著性模型54.660 00.933 010.980 00.005 6**A11.700 01.700 019.950 00.004 3**B11.650 01.650 019.420 00.004 5**C11.060 01.060 012.500 00.012 3*D10.200 20.200 22.360 00.175 7E10.057 40.057 40.675 70.442 5残差60.509 80.085 0R20.901 5总离差115.170 0注：“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；下表同。由表4可知，主效应P值为0.005 6，设计因素在其所选水平内对发酵药渣中乳酸菌数量的影响显著，决定系数R2为0.901 5，表明试验设计具有可靠性。表中5个影响因素依P值大小显著性排序为：药渣含水量初始pH值发酵温度发酵时间接种量，其中药渣含水量、初始pH值和发酵温度对发酵药渣中乳酸菌数具有显著影响（P0.05），后续试验重点考察这3个因素的最优水平范围。2.3响应面分析结果2.3.1Box-Behnken试验设计利用Box-Behnken建立3因素3水平的响应面模型，因素水平分别为：含水量50%、60%、70%，初始pH值6.00、6.25、6.50，发酵温度30、33、37 ℃，以发酵黄芩药渣中乳酸菌数量为响应值，Box-Behnken设计方案及结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T005表5Box-Behnken设计方案及结果序号ABC有效活菌数/(×108 CFU/g)10117.2521017.3730008.114-1-106.825-1016.92610-17.847-10-16.9980008.3990-117.34100008.53111107.8212-1107.23130008.171401-17.99151-107.48160-1-17.03170008.262.3.2模型建立与显著性检验采用Design Expert 12.0进行多元回归拟得响应面数据分析，以药渣含水量、初始pH值和发酵温度为响应变量，以发酵黄芩药渣中乳酸菌数量为响应值，得到关于发酵黄芩药渣中乳酸菌数量的二次多项回归模型方程：Y=8.292+0.318 75A+0.202 5B－0.121 25C－0.017 5AB－0.1AC－0.262 5BC－0.538 5A2－0.416B2－0.473 5C2回归方程方差分析见表6，模型P值0.000 1，差异极显著，失拟项P0.05，失拟不显著，决定系数R2为0.975 8，说明该回归方程拟合度较好，可以确定最佳发酵条件。分析结果显示，药渣含水量和初始pH值达到极显著水平，发酵温度达到显著水平；3因素之间的交互作用对乳酸菌有效活菌数影响显著，二次项的发酵温度达到极显著水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.T006表6回归方程方差分析变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型4.800 090.533 831.420 00.000 1**A0.812 810.812 847.850 00.002 2**B0.328 010.328 019.310 00.003 2**C0.117 610.117 66.920 00.033 8*A20.001 210.001 20.072 10.796 0B20.040 010.040 02.350 00.168 8C20.275 610.275 616.230 00.005 0**AB1.220 011.220 071.880 00.000 1**AC0.728 710.728 742.900 00.000 3**BC0.944 010.944 055.570 00.0001**残差0.118 970.017 0失拟项0.003 630.001 20.041 90.986 9存误差0.115 340.028 831.420 0总计4.920 016R20.975 8R2adj0.944 82.3.3最佳发酵条件预测及模型验证采用Design Expert 12.0对回归模型进行优化分析，药渣含水量、初始pH值、发酵温度对发酵黄芩药渣中乳酸菌数影响的响应面图和等高线见图6。由图6可知，AB、BC、AC间交互作用显著。通过软件分析，得到发酵黄芩药渣中乳酸菌数量最佳条件为：药渣含水量63%、初始pH值6.30、发酵温33 ℃。此条件下，得到的预测乳酸菌有效活菌数的最大理论值为8.37×108 CFU/g。平行3次试验，验证试验平均值为8.32×108 CFU/g，与预测值相近，该模型能够较好地预测黄芩药渣发酵条件。图6药渣含水量、初始pH值、发酵温度对发酵黄芩药渣中乳酸菌数影响的响应面和等高线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F6a1（a）含水量和初始pH值对乳酸菌数量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F6a2（b）含水量和发酵温度对乳酸菌数量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.04.017.F6a3（c）初始pH值和发酵温度对乳酸菌数量的影响3讨论饲料禁抗后，如何增强畜禽免疫力、减少患病得到重视与关注[12-13]。利用药渣中的活性成分制备饲料添加剂，可以代替抗生素增强畜禽免疫力，减少疾病发生，而且能够为废药渣找到合理的利用途径[14]。多数中药渣因气味和口感辛辣刺鼻，动物适口性差，很难直接作为饲料添加剂应用[15-17]。乳酸菌发酵可以改变原有底物中大分子物质含量，使之转化为更容易被吸收利用的小分子物质，更能够赋予发酵产物独特的芳香气味，提高畜禽进食量[18-19]。本研究发现，药渣含水量是影响乳酸菌数量的显著因素，含水量过低时，不利于乳酸菌生长。当含水量超过70%时，乳酸菌数量显著降低，药渣中杂菌数量显著增多，反映发酵药渣湿度过大不利于保存的现状。发酵药渣的初始pH值对乳酸菌数量的影响也至关重要。过低的pH值抑制乳酸菌初期生长，随着乳酸菌生长达到对数期，药渣pH值会随着下降。植物乳杆菌L20201为实验室自主分离发酵菌株，生长过程中能够快速降低发酵液pH值，短时间内达到防腐的效果。研究表明，经响应面法优化后发酵黄芩药渣中乳酸菌数量显著升高，可以为发酵药渣的后续应用提供参考。4结论通过单因素试验获得了含水量、初始pH值、发酵温度、发酵时间、接种量的最佳范围。在此基础上，通过Plackett-Burman爬坡试验筛选出药渣含水量、初始pH值和发酵温度3个发酵关键因素；应用Box-Behnken响应面法进行优化试验设计，得到植物乳杆菌发酵黄芩药渣最佳条件为：药渣含水量63%、初始pH值6.30、发酵温33 ℃，得到最高发酵活菌数为8.32×108 CFU/g，活菌数与预测所得到的乳酸菌有效活菌数的最大理论值8.37×108 CFU/g相近，模型能够较好地预测黄芩药渣发酵条件。