养殖业中，低于30 kg仔猪的成活率关系到仔猪的平均发病率、死亡率以及养殖户的经济损失[1-4]。仔猪腹泻包括新生仔猪胃肠道发育不完全导致肠道有害菌增多的生理性腹泻、饲料配比不科学引起的营养性腹泻、病原微生物引起的病理性腹泻以及饲养管理不当引起的应激性腹泻[5-8]。新生仔猪胃肠道内建立有益的微生物系区，利于肠道对养分的消化吸收，能够增强机体免疫力和抗氧化能力，提高其生长性能[9-12]。双歧杆菌存在于动物体的肠道和口腔[13]。双歧杆菌是人和动物肠道内主要的生理性细菌之一[9]，具有维持微生态平衡、生物拮抗、免疫调节、抗菌、消炎和营养等生理保健功能[8,14-17]。Abe等[18]研究发现，双歧杆菌能够提升新生仔猪的存活率与日增重。Estrada等[19]在断奶仔猪日粮中添加双歧杆菌，仔猪断奶后的日增重显著提高。李海珍[20]在仔猪2、7、14日龄时人工灌服双歧杆菌，结果发现，哺乳仔猪的平均日增重显著提高。目前少有双歧杆菌复合益生菌制剂应用效果的报道。本试验旨在验证该制剂对哺乳仔猪生长性能、免疫功能及腹泻的影响，为微生态制剂在养殖业中的普遍应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料双歧杆菌复合益生菌制剂购自大北农养猪研究院，双歧杆菌≥3×105 CFU/mL、酿酒酵母≥4×105 CFU/mL、乳酸菌≥3×105 CFU/mL，总益生菌数＞1×1011/mL。1.2试验设计试验最初设计为2组母猪均为8头以上，实际操作按照胎次、体重和其他遗传背景一致的原则，随机分为对照组和双歧杆菌复合益生菌组，各选12头母猪，但对照组1头、益生菌组2头母猪在生产过程中出现产子数少、产子时间延后等问题无法纳入本试验，因此本试验对照组11头、益生菌组10头，共21头母猪。分娩后对仔猪进行称重、调栏，保持各组母猪初始带仔数和平均窝重尽量一致，每窝仔猪约11.5头，以每窝仔猪为1个重复。益生菌组仔猪在初生第1和第3 d分别灌服3 mL双歧杆菌复合益生菌制剂（实测双歧杆菌3.45×109 CFU/mL），对照组仔猪灌服等量生理盐水，试验期21 d。1.3饲养管理试验在江西泰和绿色巨农农牧食品有限公司进行。除灌服操作外，其他仔猪免疫及管理按照猪场常规程序进行。哺乳母猪按照猪场日常饲喂和管理程序饲养。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能仔猪出生24 h内调栏，记录每栏仔猪初生重量和仔猪头数。本试验对象为哺乳仔猪，无法计量猪乳摄入量，且教槽阶段饲料摄入受猪个体差异极大，不具备科学参考价值，故本批次试验仅于仔猪21日龄时记录仔猪断奶重及断奶头数，计算平均日增重(ADG)和死亡率。平均日增重=(末重－初重)/试验天数(1)1.4.2腹泻率试验期间，每天观察记录每栏猪肛门和猪粪情况，记录腹泻猪头数，计算腹泻率。腹泻率=腹泻头次／(试验头数×试验天数)×100%(2)1.4.3血清免疫及生化指标试验第20 d，每个重复随机挑选1头仔猪，前腔静脉采集3~5 mL血液，静置分离血清，转移至管冻存中，于-80 ℃环境保存。利用迈瑞全自动生化分析仪对血清中炎症因子、抗体水平、生化指标并进行分析检测。检测指标为：白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）、血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）。1.4.4粪便微生物组成试验第20 d，每个重复随机选择1头健康仔猪进行采粪，置于-80 ℃环境保存。采用Illumina HiSeq测序平台对不同处理组哺乳仔猪粪便菌群进行16S rRNA测序分析。1.5数据统计与分析试验数据采用SAS 9.2统计软件中GLM模型进行方差分析（ANOVA），生长性能数据以栏为单位，利用Tukey法多重比较检验，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。采用χ2检验比较各组间的死亡率和腹泻率，差异显著后，采用Bonferroni校正，进行两两比较，显著性水平设置为0.05/4=0.012 5。2结果与分析2.1双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪生长性能的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，新生仔猪灌服双歧杆菌复合益生菌制剂对生长性能无显著影响（P0.05），但数值上使断奶仔猪的窝均增重增加4.25 kg（7.56%），平均日增重增加13 g（5.08%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.007.T001表1双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪生长性能的影响项目对照组益生菌组P值母猪头数/头1110—初始带仔数/头11.55±0.1611.50±0.310.379断奶仔猪数/头11.09±0.2811.30±0.340.152初始窝重/kg17.30±0.9517.34±0.960.437断奶窝重/kg73.52±3.6177.81±3.470.243窝增重/kg56.22±3.0560.47±2.620.220仔猪初始均重/kg1.50±0.081.51±0.070.692仔猪断奶均重/kg6.62±0.286.89±0.240.859平均日增重/[g/(头·d)]256.00±11.00269.00±9.000.850注：初始带仔数为前3天调栏并校正死亡率的数值。2.2双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪死亡率和腹泻率的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，益生菌组增加断奶头数0.21头，降低了仔猪断奶前死亡率2.2%；益生菌组仔猪的第2周、前2周和断奶前全期的腹泻数、腹泻率与对照组相比，均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.007.T002表2双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪死亡率和腹泻率的影响项目对照组益生菌组χ2P值初始带仔数/头11.5511.50——断奶仔猪数/头11.0911.30——死亡例数/头(死亡率/%)5.00(3.94%)2.00(1.74%)2.570.463腹泻例数/头(腹泻率/%)第1周17.00(3.40%)17.00(3.76%)4.220.239第2周80.00(9.22%)a20.00(2.53%)b53.350.010前2周97.00(7.09%)a37.00(2.98%)b36.760.010全期98.00(4.95%)a37.00(1.93%)b36.940.010注：1.同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.前3 d处于分娩调栏阶段，变动大，未统计腹泻情况；“—”表示未统计。2.3双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪血清细胞因子和抗体水平的影响（见表3、表4）由表3可知，与对照组相比，益生菌组的哺乳仔猪血清中IL-1β、TNF-α、TNF-β的水平显著高于对照组（P0.05），仔猪血清中的IL-2的水平显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.007.T003表3双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪血清中细胞因子的影响项目对照组益生菌组P值IL-1β23.13±5.04b37.49±2.88a0.010IL-2219.92±16.41b250.34±19.08a0.050TNF-α54.41±1.53b69.70±3.28a0.010TNF-β42.13±2.71b49.91±4.86a0.010ng/L由表4可知，与对照组相比，添加双歧杆菌复合益生菌制剂以后，哺乳仔猪血清中IgG的水平显著低于对照组（P0.05），但TP、ALB、IgM、IgA的水平均无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.007.T004表4双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪血清中蛋白和抗体水平的影响项目对照组益生菌组P值TP88.91±28.4880.13±16.430.528ALB38.50±9.8834.75±6.590.457IgG10.95±0.80a8.90±1.32b0.010IgM0.94±0.150.83±0.120.165IgA1.27±0.571.01±0.240.322ng/L2.4双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪粪便微生物组成的影响（见图1）由图1可知，灌服益生菌后，显著提高仔猪粪便中乳杆菌属（Lactobacillus）和Subdoligranulum属菌群的相对丰度（P0.05），粪便中的埃希氏菌属（Escherichia）相对丰度呈现出下降的趋势（P0.05）。结果表明，灌服双歧杆菌复合制剂能够有效地提高哺乳仔猪消化道内的有益菌丰度，抑制有害菌的生长，有利于改善肠道健康。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.007.F001图1双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪粪便微生物组成的影响3讨论3.1双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪生长性能的影响仔猪出生后会因自身缺少抗体、接触母猪粪尿、寒冷应激和胃肠道发育不完全等原因导致腹泻的发生[21]。Shu等[22]发现，断奶仔猪日粮中添加益生菌能够增强免疫能力，降低轮状病毒和大肠杆菌引起的断奶腹泻的严重程度。双歧杆菌作为消化道内的优势菌，具有维持肠道健康与微生态平衡、提高动物生产性能的特点[23]。赵桂英等[24]将双歧杆菌发酵液均匀喷洒在仔猪试验日粮上，验证了双歧杆菌提高仔猪日增重的能力。杨翔华等[25]发现，口服双歧杆菌可以消除肠菌群紊乱、恢复原有平衡，达到治疗腹泻的目的。田瑞云等[26]连续7 d给哺乳仔猪灌服不同含量双歧杆菌发酵液，显著提高了仔猪的平均日增重，降低仔猪腹泻率，发现以每天每头仔猪灌服1.2×108 CFU双歧杆菌增重效果最为显著。研究表明，哺乳仔猪灌服109~1010 CFU的双歧杆菌能够显著改善仔猪的肠道健康水平与微生物区系[27-29]。本研究得出与前人报道相似的结论，双歧杆菌复合益生菌制剂显著降低了腹泻率与死亡率，处理组窝重和平均日增重与对照组相比也有增高的趋势，未产生显著性差异原因在于与试验所用益生菌的饲喂量、双歧杆菌含量和添加方式等有关。本研究选择第1 d和第3 d灌服双歧杆菌，考虑到仔猪出生时未接触外界微生物，第一时间进行灌服能够有效地在其胃肠道内建立优势菌群，第3 d补铁时再次灌服能够在不增加饲养员工作量条件下加强仔猪肠道内有益菌的定植。3.2双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪血清细胞因子和抗体水平的影响血清IL-1β作为促炎因子，通过促进炎症应答提高机体抗感染作用[30]；IL-2可以激活T细胞并促进细胞因子生成，在机体免疫应答和抗病毒过程中发挥重要作用[31]；TNF-α与TNF-β分别是由单核巨噬细胞和活化的T淋巴细胞合成和分泌，均可以提升T细胞的免疫应答功能[32]。赵桂英等[33]发现，双歧杆菌可使仔猪血液中炎症因子水平升高。孟祥晨等[34]发现，婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌能够通过提高血液中炎症因子的水平对正常小白鼠免疫功能产生积极作用。本研究发现，灌服双歧杆菌复合益生菌制剂能够显著提高哺乳仔猪血清中IL-1β、TNF-α、TNF-β的水平，说明灌服双歧杆菌能够有效地提高哺乳仔猪免疫细胞的动员能力与自身的免疫力。血清免疫球蛋白是由B淋巴细胞产生，具有增强抗病毒和预防感染的能力，在免疫应答过程中发挥重要作用[35-36]。IgA是肠道最重要的保护性抗体[37]；IgM是初次免疫应答的重要产物[38]；IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，自然被动免疫和初级免疫应答中发挥重要作用[39]。赵桂英等[40]将双歧杆菌均匀喷洒在断奶仔猪全价料上，仔猪血清中IgG的水平显著高于对照组。本试验结果，仔猪体内的免疫球蛋白来源于母乳和仔猪体内的自身合成[37]，同样饲喂条件仔猪从母乳中获得IgG水平大致相同，灌服双歧杆菌复合益生菌制剂导致哺乳仔猪血清中IgG的水平降低可能是自身合成的差异。免疫球蛋白的自身合成依赖于病原菌感染、抗原呈递、B细胞分化等一系列的过程[41-42]，血清中更低的IgG水平可能与仔猪受到更少的病原菌入侵有关。本试验结果表明灌服益生菌能够在一定程度上减少有害菌在肠道内的感染。3.3双歧杆菌复合益生菌制剂对哺乳仔猪粪便微生物组成的影响腹泻仔猪与健康仔猪肠道菌群的多样性和组成结构存在显著差异，健康仔猪肠道内乳杆菌、拟杆菌、双歧杆菌等益生菌占据优势；腹泻仔猪肠道内大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌更有可能成为优势菌群[43-44]。本试验中，所用的益生菌均为活菌，灌服20 d后仔猪的肠道微生物区系与血液生化指标相比于对照组仍有变化，说明益生菌灌服后能够定植于仔猪肠道，建立以有益菌为主的肠道微生物区系，并长期发挥作用，从肠道健康的角度证明双歧杆菌益生菌复合制剂灌服后对哺乳仔猪生产性能与腹泻率的改善作用。本试验不同组粪便微生物分析结果显示，益生菌组显著提高仔猪粪便中乳杆菌属和粪便中Subdoligranulum属菌群的丰度，降低了Escherichia与志贺氏菌属（Shigella）的相对丰度，与前人口服双歧杆菌抑制有害菌在肠道定植的结果相一致[45]。当肠道发生炎症时，肠道中Subdoligranulum属菌群丰度会急剧降低[46]。本试验结果显示，试验组Subdoligranulum属菌群的丰度显著提高，说明灌服双歧杆菌复合益生菌制剂降低仔猪肠道内的炎症水平。汪群等[47]研究发现，腹泻仔猪粪便中Escherichia与Shigella菌属相对丰度高于健康仔猪。因此，本试验处理使仔猪粪便中这两类菌属相对丰度减少，可能是仔猪腹泻率降低的重要原因之一。4结论仔猪出生及3日龄时灌服双歧杆菌复合益生菌制剂，可以使仔猪肠道内的有益菌建立优势，从而改善肠道健康，提高仔猪免疫能力，并最终降低仔猪腹泻率与死亡率，提高生长性能。