水产动物大规模的集约化养殖使得我国的水产养殖业迅猛发展[1]。高密度及粗放型饲养增加水体污染并使水产动物易受到菌毒侵害。在水产养殖中禁止使用抗生素[2-6]。因此，寻找能够替代抗生素的饲料添加剂迫在眉睫。益生菌作为可调节肠道微生物平衡的活菌制剂，被视为绿色环保替代抗生素的免疫增强剂[7]。益生菌主要包括复合益生菌和单一益生菌两类[8]。研究结果显示，复合益生菌能够显著提高肉鸡平均日增重，降低料肉比，改善肠道形态[9]；能够显著提高断奶仔猪平均日增重，提高肠道菌群多样性，改善肠道形态和吸收功能。但复合益生菌在水产动物养殖生产中的报道较少。大菱鲆从欧洲引入后成为我国北方水产养殖的重要品种[10-11]，由于内源性及外源性的影响，导致大菱鲆的健康状况、营养水品及环境适应力极为不稳定，因此限制了大菱鲆产业在我国的发展。试验研究饵料中添加复合益生菌对大菱鲆生长性能、免疫水平及肠道健康的影响，为大菱鲆的养殖产业发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用复合益生菌购自韩国O.B.T公司，主要含有凝结芽孢杆菌5×109 CFU/g、枯草芽孢杆菌1.5×1010 CFU/g及丁酸杆菌2×109 CFU/g。试验鱼购自广东大菱鲆良种场，将其暂养7 d进行正式试验。1.2试验方法1.2.1试验设计试验选取180尾、体重为（7.36±0.04）g的大菱鲆幼鱼，随机分成3组，每个处理组3个重复，每个重复20尾鱼。对照组饲喂基础日粮（0添加）；0.4%复合益生菌组饲喂基础日粮+4 g/kg复合益生菌；0.8%复合益生菌组饲喂基础日粮+8 g/kg复合益生菌。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.013.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生菌组营养水平对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生菌组合计100.0100.0100.0鱼粉50.050.050.0水分12.8212.8212.82豆粕20.020.020.0灰分12.2612.2612.26次粉9.59.59.5粗蛋白50.5850.5850.58虾糠1.41.41.4粗脂肪9.639.639.63维生素及矿物质2.02.02.0鱼油4.84.84.8大豆油3.03.03.0大豆卵磷脂2.02.02.0磷酸二氢钙1.81.81.8氯化胆碱0.50.50.5微晶纤维素5.04.64.2复合益生菌00.40.8注：1.维生素和矿物质购自河北皓海生物科技有限公司。2.营养水平均为计算值。%试验期为60 d。饲料粉碎，过60目筛，使用螺旋挤压制粒机配置直径为2.0 mm的饲料，-20 ℃保存。1.2.2饲养管理试验在200 L方形蓝色水槽内饲养，水温控制在18 ℃，盐度（2±0.20）‰，pH值7.35~7.42，溶氧为（6.93±0.58）mg/L。每日于7：00和16：00以表观饱食饲喂，每次饲喂前吸取粪便及残余饲料，换水为总体积的2/5~3/5，称重并记录饲喂量。试验期光照一致，每周测定水体盐度、溶氧、温度及pH值。1.2.3样品采集试验第60 d，大菱鲆生长性能测定，且测定前禁食24 h，称重，计算体增重、平均生长率、日采食量和饲料转化率。随机选取4尾大菱鲆尾静脉采血4 mL，用离心机12 000 r/min离心15 min，取上层血清，置于-80 ℃用于血生化分析。每个处理随机选取4尾大菱鲆，测定背肌和鱼体的水分、粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分。1.2.4指标测定及方法1.2.4.1生长性能体增重=[(末重-初重)/初重]×100% (1)特定生长率=(ln末重-ln初重)/试验天数×100%(2)饵料系数=采食量/湿增重(3)存活率=(最终鱼数/初始鱼数)×100%(4)肥满度=(试验鱼体重/鱼体长3)×100%(5)脏体比=内脏重量/末重×100%(6)肝体比=肝脏重量/末重×100%(7)1.2.4.2肌肉及鱼体营养成分分析背肌及鱼体营养成分含量按照中华人民共和国国家标准测定，包含水分（GB/T 6435—2006）、粗蛋白（GB/T 6432—1994）、粗灰分（GB/T 6438—2007）、粗脂肪（GB/T 6433—1994）。1.2.4.3血清抗氧化及非特异性免疫水平血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）含量和总抗氧化能力（T-AOC）均采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。溶菌酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶用日立7600全自动生化分析仪测定。1.2.4.4肠道形态试验第60 d，每个重复，随机选取4尾大菱鲆麻醉致死取中肠样，用10%中性福尔马林缓冲液贮存肠道片段。采用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成4 μm切片，HE染色（苏木精染核和伊红染胞质），在每个部位组织切片上选取6个绒毛完整且走向平直视野，用真彩图像分析软件采集图像并分析绒毛高度和隐窝深度。1.3数据统计与分析试验数据采用SAS GLM模型进行单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。P0.05表示差异显著，P0.10表示趋于显著。2结果与分析2.1复合益生菌对大菱鲆生长性能及形体指标的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，饲料中添加复合益生菌的处理组大菱鲆饵料系数显著降低（P0.05），0.8%复合益生菌组大菱鲆饲料系数较0.4%复合益生菌组低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.013.T002表2复合益生菌对大菱鲆生长性能及形体指标的影响项目对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生组SEMP值初始体重/g7.397.427.410.040.14终末体重/g21.0121.8022.140.690.18特定生长率/(%/d)1.741.791.820.080.23增重率/%184.30193.80198.780.230.30饵料系数1.14a1.07b1.03b0.300.02成活率/%100.00100.00100.000.030.79肥满度/(g/cm3)3.123.233.280.050.18脏体比/%4.564.534.550.530.33肝体比/%1.011.031.030.020.24注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2复合益生菌对大菱鲆肌肉及鱼体成分的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，0.4%复合益生菌组与0.8%复合益生菌组肌肉粗蛋白含量显著增加（P0.05）。与对照组相比，0.4%复合益生菌组与0.8%复合益生菌组鱼体粗蛋白含量显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.013.T003表3复合益生菌对大菱鲆肌肉及鱼体成分的影响项目对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生菌组SEMP值肌肉水分78.7278.5478.460.230.27粗脂肪5.647.177.500.320.19粗灰分8.938.478.260.420.28粗蛋白61.58b68.20a68.90a2.370.04鱼体水分75.4475.8775.900.820.43粗脂肪21.6020.3720.861.720.19粗灰分13.9311.7111.861.480.28粗蛋白61.39b64.31a64.9a1.370.04%2.3复合益生菌对大菱鲆血清抗氧化及非特异性免疫水平的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，0.4%复合益生菌组与0.8%复合益生菌组大菱鲆血清的超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力显著增加（P0.05）。0.4%复合益生菌组与0.8%复合益生菌组大菱鲆血清的溶菌酶水平显著高于对照组（P0.05），且0.8%复合益生菌组的溶菌酶在数值上高于0.4%复合益生菌组。与对照组相比，0.4%复合益生菌组与0.8%复合益生菌组大菱鲆血清的谷丙转氨酶与谷草转氨酶水平未见明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.013.T004表4复合益生菌对大菱鲆血清抗氧化功能及非特异性免疫水平的影响项目对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生菌组SEMP值超氧化物歧化酶116.51b128.48a128.98a1.170.03总抗氧化能力3.45b5.51a5.25a0.920.02过氧化氢酶5.515.635.540.160.82溶菌酶24.56b32.34a44.14a6.240.01谷丙转氨酶9.779.549.680.230.34谷草转氨酶183.23179..84182.220.340.22U/mL2.4复合益生菌对大菱鲆肠道形态的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，饲料中添加复合益生菌的处理组大菱鲆的绒毛高度显著提高（P0.05），隐窝深度显著降低（P0.05）。添加复合益生菌处理组大菱鲆的绒毛高度与隐窝深度的比值显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.013.T005表5复合益生菌对大菱鲆肠道形态的影响项目对照组0.4%复合益生菌组0.8%复合益生菌组SEMP值绒毛高度/μm31.57b39.28a39.95a5.430.04隐窝深度/μm2.57a2.24b2.32b0.420.01绒毛/隐窝12.57b17.53a17.22a6.230.033讨论3.1复合益生菌对大菱鲆生长性能的影响目前，大菱鲆养殖是我国主要鱼类产业之一。集约化及工业化的养殖模式会产生水体污染及菌毒侵害鱼体，生长性能造成负面影响，降低经济效益[12]。抗生素作为促生长添加剂，具有促进动物生长及增强抗病力的功能，但耐药性以及残留对人体有一定的侵害[13]。复合益生菌被视为具有健康、绿色且安全的抗生素替代潜力产品[14]。柯浩等[15]研究表明，日粮中添加复合益生菌能够改善罗非鱼生长性能。何伟聪等[16]结果显示，饵料中添加益生菌对曹鱼生长性能具有改善作用。潘雷等[17]研究表明，日粮中添加益生菌能够降低饵料系数，与本研究结果一致。本研究中，饲料中添加复合益生菌组的饵料系数显著降低，且0.8%复合益生菌组的饵料系数较0.4%复合益生菌组的低，但初始体重、终末体重、特定生长率、增重率及成活率无影响。日粮中添加复合益生菌能够提高饵料利用效率，且饵料利用效率高低与复合益生菌添加量有关。水产动物肠道健康对营养物质的吸收有重要作用，复合益生菌能够清除肠内有害菌，维持肠道微生态环境稳定，从而促进营养物质吸收，提高饵料转化效率[18]。3.2复合益生菌对大菱鲆肌肉及鱼体成分的影响鱼体及肌肉的粗蛋白质、脂肪及灰分等营养成分组成及比例与日粮组成存在重要关系。水产动物中添加益生菌对肌肉及鱼体营养成分的影响结果各异。周晓波等[19]研究显示，奥尼罗非鱼日粮中添加乳酸菌能够提高鱼体粗蛋白质含量，水分含量降低。胡亚军等[20]结果显示，黄鳝日粮中添加益生菌对粗蛋白质和粗脂肪无影响，粗灰分含量显著提高。本试验结果表明，大菱鲆日粮中添加复合益生菌组鱼体及肌肉中粗蛋白质含量显著增加，但水分、粗脂肪及粗灰分无影响。复合益生菌对鱼体及肌肉中营养成分的影响结果不同，可能受试验动物的种类、饲养环境及益生菌的种类和活力影响[18]。此外，日粮中添加复合益生菌组鱼体和肌肉蛋白质含量升高，可能是复合益生菌能够促进蛋白质吸收，进而提高蛋白质在鱼体和肌肉中沉积[21]。3.3复合益生菌对大菱鲆抗氧化及非特异性免疫水平的影响集约化水产动物养殖面临免疫水平低及抗病力弱的问题。Shen等[22]研究表明，日粮中添加枯草芽孢杆菌能够提高血清超氧化物酶和总抗氧化能力的活性。本研究结果发现，大菱鲆日粮中添加复合益生菌能够提高血清的超氧化物歧化酶和总抗氧化能力的活力，能够提高大菱鲆血清的溶菌酶活性，与潘雷等[17]研究结果一致。复合益生菌能够改善大菱鲆抗氧化能力[23]及溶菌酶的活性，通过刺激细胞免疫及体液免疫改善动物免疫功能[24]，通过调节肠道增强抗氧化能力[18,25]。3.4复合益生菌对大菱鲆肠道形态的影响肠道形态及组织结构对水产动物的生长发育和营养消化吸收极其重要[26]。肠道绒毛通过增加肠内表面积促进营养物质充分利用吸收[27-30]。本研究结果表明，大菱鲆日粮中添加复合益生菌组绒毛高度显著提高，隐窝深度显著降低，添加复合益生菌组的绒毛高度与隐窝深度的比值显著高于对照组。结果表明，日粮中添加复合益生菌能够改善水产动物的肠道形态，改善动物对营养物质的吸收利用效率[18]。4结论本研究表明，大菱鲆日粮中添加复合益生菌能够增强抗氧化及非特异性免疫功能和改善肠道健康，进而提高饵料转化效率，降低养殖成本。