β-胡萝卜素作为药品被收载于美国药典（USP43-NF38）、欧洲药典（EP10.6）和英国药典（BP2021）。我国规定，作为药品应列入国家药品标准WS1-（X-035）-2006Z；作为食品添加剂应列入国标GB 1886.317—2021和T/ZZB 1682—2020；作为饲料添加剂应列入国标GB 7300.901—2019和GB 34469—2017。β-胡萝卜素作为饲料添加剂添加在动物饲料中，具有促进动物机体生长性能，降低动物饲养成本以及提高动物产品价值等作用[1]。β-胡萝卜素作为添加剂添加到饲喂小鼠的饲料中，发现对小鼠动脉粥样硬化有较好的抑制作用[2]。β-胡萝卜素的抗氧化性能够对肝脏具有良好的保护作用，有抗炎、抗凋亡的活性[3]。Lorenzo等[4]以薄荷虾为研究对象，发现β-胡萝卜素可以促进薄荷虾的存活和生长，提高卵子质量和色素沉着。β-胡萝卜素可以通过抑制内质网应激（ERS）来保护断奶诱导的细胞凋亡[5]，改善初乳和乳汁中的细胞因子状态和免疫球蛋白浓度，可以提高母猪乳汁中的乳糖浓度和母猪的免疫状态，增加断奶时的窝重和仔猪个体质量[6]。在日粮中添加β-胡萝卜素可以增强奶牛对疾病的抵抗能力[7]，能够降低奶牛亚临床型乳房炎细菌感染[8]；在整个哺乳期内为奶牛提供充足数量的β-胡萝卜素营养需求，能够确保其机体性能，并提高其生育能力[9]。β-胡萝卜素主要由化学合成而产生。越来越多的学者倾向天然类胡萝卜素，但因原材料成本及地理环境因素的限制，无法满足当下的需求。三孢布拉霉菌作为一种真菌，可用于开发β-胡萝卜素产品。以三孢布拉霉发酵液为原料，提取β-胡萝卜素纯品，多使用溶剂提炼法[10-18]制得，工艺优于色谱提取[19]与树脂吸附法。文章系统研究溶剂提炼工艺，旨在为生物法合成β-胡萝卜素、工业化生产β-胡萝卜素纯品提供参考。1材料与方法1.1试验材料三孢布拉霉发酵液购自山东胜利生物工程有限公司。1.2主要试剂乙醇（AR）购自天津市大茂化学试剂厂；醋酸乙酯（AR）购自茂名市雄大化工有限公司；环己酮（AR）购自无锡市晶科化工有限公司；石油醚（AR）购自国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷（AR）购自济南鑫沃化工有限公司；乙酸丁酯（AR）购自天津市河东区红岩试剂厂；环己烷（AR）购自国药集团化学试剂有限公司。1.3主要仪器UV-250 1PC型紫外可见分光光度计，购自岛津企业管理有限公司；JJ-1型增力电动搅拌器，购自江苏金坛区中大仪器厂；BS-3000A型电子天平，购自上海友声衡器有限公司；DZIW型调温电热套，购自北京市永光明医疗仪器厂；SHZ-2000型循环水真空泵，购自巩义市予华仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，购自上海精宏实验设备有限公司。1.4试验方法1.4.1β-胡萝卜素菌丝体制备三孢布拉霉正菌和负菌的菌种种子液，在接种发酵培养基前，按照正菌∶负菌=1∶22.2（体积比）的比例融合4.0~4.5 h，接种发酵，培养基发酵接种后起始搅拌转速400 r/min、24 h，每12 h提高搅拌转速50 r/min，至搅拌转速为600 r/min止，控制罐压0.05 MPa，温度为25~29 ℃有氧发酵，发酵周期200~220 h，得到β-胡萝卜素发酵液，经过滤、干燥，得到β-胡萝卜素菌丝体。1.4.2β-胡萝卜素提取工艺流程β-胡萝卜素的提取以乙酸丁酯为提炼溶剂，经过浓缩、结晶、重结晶等提炼工艺，制备高含量β-胡萝卜素纯品。具体β-胡萝卜素提取工艺流程见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.F001图1β-胡萝卜素提取工艺流程1.4.3指标测定及方法1.4.3.1供试品溶液的制备[20]精确称量β-胡萝卜素纯品0.005 g，加入石油醚约5 mL研磨，沉淀片刻，移取上清液于25 mL棕色容量瓶中，剩下残渣再加入5 mL石油醚研磨，如此反复，多次提取，直至研钵中的试料颜色为无色，稀释至刻度，摇匀。取4 mL置于100 mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀待用。精确量取浸提液0.1 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀待用。1.4.3.2β-胡萝卜素含量的测定[20]取1.4.3.1中已制备的试液，置于1 cm石英池中，用紫外分光光度计，在波长为（455±1）nm处测定其吸收度A，以环己烷为空白对照。参照下面公式，计算β-胡萝卜素含量。X1=A×V2m1×V1×E1 cm1% (1)式中：A为吸收度；m1为样品称量质量（g）；V1为吸取石油醚提取液体积（mL）；V2为环己烷稀释液的总体积（mL）；E1 cm1%为β-胡萝卜素的标准百分吸收系数（E1 cm1%=2 500）。2结果与分析2.1不同溶剂对β-胡萝卜素溶解度的影响（见表1）取适量β-胡萝卜素菌丝体，在25 ℃条件下，分别用丙酮、90%丙酮溶液、80%丙酮溶液、70%丙酮溶液、乙醇、乙酸乙酯等多种试剂提炼2 h，取样，检测浸提液中β-胡萝卜素的含量。由表1可知，环己酮提炼效果最优，但以安全高效为原则，优先选择三类溶剂，控制二类溶剂，避免使用一类溶剂及混合溶剂。本试验中选乙酸丁酯作为提炼溶剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.T001表1不同溶剂对β-胡萝卜素溶解度的影响溶剂类型含量/(g/L)丙酮0.524 490%丙酮溶液0.124 880%丙酮溶液0.041 270%丙酮溶液0.001 2无水甲醇0.078 8无水乙醇0.211 6乙酸乙酯0.988 0乙酸乙酯∶无水乙醇=2∶10.566 0石油醚0.918 8石油醚∶丙酮=2∶11.527 2石油醚∶丙酮=4∶11.527 2正己烷1.007 2乙酸乙酯∶丙酮=2∶11.092 0环己酮1.672 0乙酸丁酯1.180 0二氯甲烷1.460 0氯仿1.700 02.2提炼温度对β-胡萝卜素溶解度的影响取适量β-胡萝卜素菌丝体，分别在25、35、45、55 ℃条件下采用乙酸丁酯提炼，检测浸提液中β-胡萝卜素含量。不同温度下乙酸丁酯中β-胡萝卜素溶解度结果见表2。由表2可知，温度越高，提炼效果较好。鉴于β-胡萝卜素热稳定性较差，兼顾动力成本与安全因素，确定45 ℃为提炼温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.T002表2不同温度对β-胡萝卜素溶解度的影响温度/℃含量/(g/L)251.21352.35454.05554.762.3不同提炼时间对β-胡萝卜素溶解度的影响取适量β-胡萝卜素菌丝体，在45 ℃条件下，采用乙酸丁酯进行提炼：分别于0.5、1.0、2.0 h取样，检测提取液中β-胡萝卜素的浓度。不同浸提时间下乙酸丁酯中β-胡萝卜素溶解度结果见表3。由表3可知，浸提时间的延长，浸提液中β-胡萝卜素含量逐渐增加。试验兼顾时间成本与提炼效率两方面因素，优选提炼时间为1 h，乙酸丁酯中β-胡萝卜素含量为3.96 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.T003表3不同提炼时间对β-胡萝卜素溶解度的影响浸提时间/h含量/(g/L)0.53.161.03.962.04.152.4不同提炼液料比对β-胡萝卜素溶解度的影响在45 ℃条件下，试验采用不同料液比溶剂浸提β-胡萝卜素，对比不同料液比对提炼效率的影响。不同料液比对浸提率的影响结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.T004表4不同提炼液料比对β-胡萝卜素溶解度的影响一次提炼液料比/(mL/g)二次提炼液料比/(mL/g)三次提炼液料比/(mL/g)菌渣含量/%10——0.35107—0.1810770.15注：“—”表示不适用。由表4可知，考虑到溶剂套用情况、菌渣残留、生产设备承受能力等情况，确定一次提炼液料比为10 mL/g，二次提炼液料比为7 mL/g。二次提炼与三次提炼，菌渣中剩余有效成分相差不多，本着节约时间、动力、原材料成本的原则，没必要进行三次提炼。2.5不同洗涤次数对β-胡萝卜素粗精粉质量影响（见表5）浓缩液降温析出粗精粉含量约80%，需乙醇搅拌洗涤，考察洗涤粗精粉次数对β-胡萝卜素纯品质量的影响。由表5可知，洗涤次数的增加，β-胡萝卜素纯品含量逐渐增加。洗涤2次得到β-胡萝卜素纯品含量在95%左右。胡萝卜素不同形态见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.T005表5不同洗涤次数对β-胡萝卜素粗精粉质量的影响洗涤次数β-胡萝卜素含量/%185295396图2胡萝卜素不同形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.F2a1（a）β-胡萝卜素菌丝体10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.F2a2（b）β-胡萝卜素纯品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.018.F2a3（c）β-胡萝卜素晶型3结论通过对提炼溶剂、提炼温度、提炼时间、料液比、重结晶洗涤次数等单因素的研究，优化β-胡萝卜素提炼工艺：提炼溶剂为乙酸丁酯、提炼温度45 ℃、2次提炼时间1 h、1次提炼料液比为1∶10、2次提炼料液比1∶7、粗品乙醇洗涤2次，可获得含量高达95%的β-胡萝卜素纯品，提炼收率可达85%，产品总收率约70%。部分产品残留在母液中，未来拟进行母液2次结晶或母液套用，提高工艺总收率。相比较大孔树脂吸附、色谱提取、混合溶剂提取等β-胡萝卜素的分离纯化方法，此工艺的操作简单、对设备要求较低、稳定可行、所用溶剂均可回收利用、对环境污染较小。本研究为工业化生产β-胡萝卜素纯品提供参考。