葡萄籽主要营养成分包括40%粗纤维，10%~20%的脂类，10%的粗蛋白质、糖类、复合矿物质和多酚[1]。葡萄籽含氨基酸和酚类物质，在动物饲料的应用中具有很大的潜力。金亚倩等[2]研究发现，在绵羊日粮中添加葡萄皮渣可以提高绵羊日增重，促进肝脏、肾脏及消化器官的发育。郝小燕等[3]研究发现，在杜寒杂交羔羊的高精饲料中添加葡萄籽原花青素可以提高羔羊瘤胃pH值，提高血清和瘤胃组织抗氧化能力，对羔羊健康具有潜在保护效应。葡萄渣中单宁、纤维素、木质素和植酸等抗营养物质，直接饲喂影响适口性、采食量，超出动物适应范围，不利动物消化、吸收和利用，影响动物的生长[4]。单宁又被称为多酚，可分为水解单宁和缩合单宁，广泛存在于水果、蔬菜、豆类及谷物中，具有降低采食量，影响饲料营养成分、利用率及对动物的毒害作用，被称为抗营养因子[5]。饲料原料中含有单宁成分会降低饲料的营养价值，因此在饲料加工过程中，采取一系列物理方法、化学方法以及生物学方法，能够减少饲料中单宁的含量[6]。生物发酵中酶菌协调发酵具有酶制剂和菌制剂二者的优点，通过协同发酵可以分解饲料中大分子物质，提高饲料原料营养品质[7]。本试验通过不同酶、菌及复合酶菌制剂，以葡萄籽为主饲料进行发酵，测定不同发酵时间、发酵温度和制剂的添加量，探索饲料中单宁的适宜降解参数，为葡萄籽资源开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料葡萄籽购自新疆伊犁某葡萄酒酿酒厂；纤维素酶购于沧州夏盛酶生物技术有限公司，H型10 000 U/g，原封装在阴凉、干燥环境保存；单宁酶由北京挑战集团提供，单宁酶试剂盒（TAN）购自苏州科铭生物技术有限公司，单宁酶活力为800 U/g。屎肠球菌由塔里木大学郭雪峰教授课题组提供，菌活力≥1×1010 CUF/g；植物乳杆菌购自沃德生物集团，菌活力≥1×1010 CUF/g，-80 ℃超低温冰箱保存。菌制剂冻干粉于4 ℃冰箱保存。1.2试验设计试验分为酶制剂组、菌制剂组和酶菌复合制剂组。空白对照组（CK）不添加任何制剂；酶制剂组内设单宁酶制剂（T）和复合酶（单宁酶+纤维素酶）制剂（FM）；菌制剂组内设屎肠球菌制剂（E）、植物乳杆菌制剂（L）、复合菌制剂（FB）；酶菌复合制剂组内设复合酶制剂＋屎肠球菌（FE）、复合酶制剂+植物乳杆菌（FL）、复合酶制剂+复合菌制剂（FMFB）。各制剂组分为高剂量组（单宁酶3 000 U/kg、纤维素酶20 000 U/kg、屎肠球菌活力109 CUF/kg、植物乳杆菌活力109 CUF/kg）和低剂量组（单宁酶2 000 U/kg、纤维素酶10 000 U/kg、屎肠球菌活力106 CUF/kg、植物乳杆菌活力106 CUF/kg）。各剂量组分别在25 ℃和30 ℃下发酵3、7和15 d。1.3试验方法挑出葡萄籽以及各原料中的杂质，葡萄籽和玉米粉碎，过40目筛；每个发酵样包含50%葡萄籽、12.5%玉米、12%豆粕、12%麸皮和12.5%棉籽壳。试验原料营养成分见表1。试验设计见表2。处理组添加剂溶于无菌水搅拌，均匀喷洒在粉碎的原料上，调整水分含量为40%。装入聚乙烯呼吸袋（15 cm×20 cm），每袋100 g发酵物原料。采用单室真空包装机抽真空，放入恒温培养箱，25和30 ℃发酵3、7和15 d。每组3个重复。发酵时间结束取出，烘干测定葡萄籽中的单宁含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T001表1试验原料营养成分原料组成水分蛋白脂肪NDFADF灰分葡萄籽9.939.2416.2560.5251.773.02玉米6.666.1413.769.823.533.56豆粕5.8945.559.1511.925.716.15棉籽壳6.205.5611.5679.3463.543.28麸皮7.0218.9713.2743.6914.916.33%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T002表2试验组别设置添加剂类型制剂种类添加剂量低剂量高剂量酶制剂/（U/kg）单宁酶制剂组2 0003 000复合酶制剂组2 000+10 0003 000+20 000菌制剂/（CFU/kg）屎肠球菌制剂组1×1061×109植物乳杆菌制剂组1×1061×109复合菌制剂组1×1061×109酶菌复合制剂复合酶制剂＋屎肠球菌2 000+1×1063 000+1×109复合酶制剂+植物乳杆菌2 000+1×1063 000+1×109复合酶制剂+复合菌制剂2 000+10 000+1×1063 000+20 000+1×109空白对照组——注：“—”表示不添加任何制剂。1.4测定指标及方法单宁含量的测定参照GB/T 27985—2011《饲料中单宁含量的测定分光光度法》，包括试样制备、单宁标准曲线的绘制和试样的测定。标准曲线为：y=0.048x+0.002 R2=0.999 4。标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.F001图1单宁酸标准曲线1.5数据统计与分析数据采用SPSS 26.0软件的单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验，LSD多重比较差异，结果以“平均值±标准差”表示，以P0.05表示差异显著。2结果与分析2.125 ℃时低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响（见表3）由表3可知，发酵时间延长，葡萄籽单宁含量呈下降趋势，各组15 d的葡萄籽单宁含量较3 d的葡萄籽单宁含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T003表325 ℃时低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响组别3 d7 d15 dT组293.33±36.41aBC252.82±21.35aBC196.85±14.73bCDFM组310.37±6.40aB251.06±17.57bBC195.11±8.33cCDE组280.18±12.07aBCD250.59±12.59bBC206.97±10.06cBCDL组267.63±4.84aCD242.94±11.65bBC202.87±10.87cBCDFB组251.86±10.67aDE226.83±7.56bCD204.62±12.00cBCDFE组294.32±9.69aBC265.50±12.83bB229.62±15.13cBFL组258.99±13.07aDE238.65±7.68abBCD226.00±11.85bBCFMFB组234.62±23.47aE212.15±13.91abD188.87±8.53bDCK组342.91±19.03aA301.51±20.86bA259.84±15.82cA注：同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05）；同列数据相同大写字母表示差异不显著（P0.05），不同大写字母表示差异显著（P0.05）；下表同。mg/kg与CK组相比，各试验组的单宁含量均显著降低（P0.05）。发酵3 d，菌制剂组的葡萄籽单宁含量显著低于FM组（P0.05）。酶菌复合制剂组、FL组和FMFB组的葡萄籽单宁含量显著低于FE组（P0.05）。发酵7 d，菌制剂组，FB组的葡萄籽单宁含量显著低于FM组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FL组和FMFB组的葡萄籽单宁含量显著低于FE组（P0.05）。发酵15 d，酶菌复合制剂组、FMFB组的单宁含量显著低于其他组（P0.05）。2.225 ℃时高剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响（见表4）由表4可知，发酵时间延长，葡萄籽单宁含量呈下降趋势。除E组和FE组外，各组15 d的葡萄籽单宁含量较3 d的葡萄籽单宁含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T004表425 ℃时高剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响组别3 d7 d15 dT组264.89±9.10aCD241.50±7.30bC224.92±8.23cCFM组306.27±21.64aB251.23±23.21bC233.37±23.52bBCE组289.23±26.38BCD251.06±22.57C250.27±19.91BCL组277.40±10.53aBCD255.86±7.16bBC238.25±8.30cBCFB组280.49±55.31aD258.43±17.79aBC174.45±8.51bDFE组304.30±26.69B281.89±27.43BC256.20±9.57BFL组294.96±7.03aBC267.70±7.50bBC247.08±9.68cBCFMFB组363.89±12.14aA350.27±9.93aA306.13±12.43bACK组342.91±19.03aA301.51±20.86bB259.84±15.82cBmg/kg发酵3 d，T组的葡萄籽单宁含量显著低于FM组（P0.05）。酶菌复合制剂组FE和FL组的葡萄籽单宁含量显著低于FMFB组（P0.05）。发酵7 d，酶制剂组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FE和FL组的葡萄籽单宁含量显著低FMFB组（P0.05）。发酵15 d，T组和FB组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P＜0.05）。2.330 ℃时低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响（见表5）由表5可知，发酵时间延长，葡萄籽单宁含量呈下降趋势。除FE组外，各组15 d的葡萄籽单宁含量较3 d的葡萄籽单宁含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T005表530 ℃时低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响组别3 d7 d15 dT组335.40±7.12aA248.39±12.33bCD218.03±19.32cBCFM组282.52±25.05aB240.32±13.55bD223.58±6.08bBE组321.54±14.17aA270.24±15.85bBC236.56±12.59cBL组264.29±19.45aB211.07±13.70bE183.62±8.06bDFB组338.65±17.44aA325.17±6.78aA285.72±10.92bAFE组277.70±13.26B263.06±15.77BC236.32±27.01BFL组263.92±9.06aB239.80±12.92bD223.17±12.53bBFMFB组256.44±18.79aB249.57±15.72aCD193.36±14.30bCCK组327.59±16.23A314.26±11.19A277.30±61.22Bmg/kg发酵3 d，FM组的葡萄籽单宁含量显著低于T组（P0.05）。菌制剂组，L组的葡萄籽单宁含量显著低于其他试验组（P0.05）。发酵7 d，除FB组外，其他试验组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。菌制剂组，L组的葡萄籽单宁含量显著低于E组和FB组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FL组和FMFB组的葡萄籽单宁含量显著低于FE制剂组（P0.05）。发酵15 d，L组、FMFB组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。菌制剂组，L组的葡萄籽单宁含量显著低于E组和FB组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FMFB组的葡萄籽单宁含量显著低于FE和FL组（P0.05）。2.430 ℃时高剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响（见表6）由表6可知，发酵时间延长，葡萄籽单宁含量呈下降趋势。除FM组和CK组外，各组15 d的葡萄籽单宁含量较3 d的葡萄籽单宁含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.015.T006表630 ℃时高剂量组酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响组别3 d7 d15 dT组331.49±60.03aCD254.45±13.33bC237.46±9.99bBFM组280.71±23.34aD225.91±30.11bE212.83±16.32bCE组253.24±13.47aF237.83±10.25abD201.64±16.52bCL组236.41±13.15aF235.62±16.31abDE196.34±16.01bCFB组283.10±8.00aEF243.08±19.38bC234.02±9.36bBFE组332.41±9.11AB329.41±17.27AB305.82±19.91AFL组272.46±16.19aDE237.18±12.81bD232.79±18.01bBFMFB组361.97±19.38aA342.31±16.55abA307.95±24.10bACK组327.59±16.23B314.26±11.19B277.30±61.22Bmg/kg发酵3 d，与CK组相比，T组、FE组以及FMFB组的葡萄籽单宁含量显著高于CK组（P0.05），其他制剂组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FL组的葡萄籽单宁含量显著低于FE组和FMFB制剂组（P0.05）。发酵7 d，与CK组相比，FE组和FMFB组的葡萄籽单宁含量显著高于CK组（P0.05），其他组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。酶制剂组，FM组的葡萄籽单宁含量显著低于T组（P0.05）。菌制剂组，E和L组的葡萄籽单宁含量显著低于FB组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FL组的葡萄籽单宁含量显著低于FE和FMFB组（P0.05）。发酵15 d，FM、E和L组的葡萄籽单宁含量显著低于CK组（P0.05）。酶制剂组，FM组的葡萄籽单宁含量显著低于T组（P0.05）。菌制剂组，E和L组的葡萄籽单宁含量显著低于FB组（P0.05）。酶菌复合制剂组，FL组的葡萄籽单宁含量显著低于FE组和FMFB组（P0.05）。3讨论3.125 ℃时添加低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响饲料中营养物质的消化、吸收和利用产生的不利影响，使得人和动物产生不良生理反应，该物质统称为抗营养因子[8]。石鸿辉等[9]用不同菌株发酵辣木茎叶粉，结果表明，混合菌种发酵效果最佳。李家明等[10]用酶菌协同发酵辣木茎秆粉，发酵7 d显著降低了植酸含量。本试验以不同酶、菌及酶菌复合制剂，以葡萄籽为主要底物进行发酵，结果显示各组较发酵前的单宁含量显著降低。外源酶和微生物的共同生化反应使得发酵物中单宁含量降低。单宁酶可催化水解葡萄糖没食子酸酯生成没食子酸和葡萄糖。反应体系中单宁酶由外源加入和微生物产出共同组成，不同菌株对不同种类的单宁降解能力和产单宁酶的能力均有差异[11]。纤维素酶可以破坏植物细胞壁结构，利于暴露出其中酚类物质与其他物质之间的化学键[12]。发酵底物中添加纤维素酶可以提高发酵效率。25 ℃添加剂量低时发酵，复合酶菌制剂组对单宁降解作用最优，说明4种添加制剂间有较好的协同作用。3.225 ℃时添加高剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响发酵时间是发酵效果优劣的重要影响因素之一。发酵时间太短，反应体系未能达到稳定期，发酵不完全；发酵时间过长，营养供应不足、菌种老化、产生有害次级代谢产物，造成菌体自溶[13]。单宁酶制剂组在25 ℃发酵3和7 d后，单宁含量均低于其他制剂组，说明此发酵条件是单宁酶活动的适宜条件。与低剂量组相比，添加量增加只对发酵前期效果产生影响，酶分子越多，底物转化越快。当酶浓度过高时，转化效率也会受到影响。反应体系中酶和菌的浓度升高，所需的反应底物和营养物质增加，但温度不是酶和菌的共适温度，此反应条件下复合酶菌制剂效果不理想。3.330 ℃时添加低剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响发酵体系稳定包括物理环境稳定和微生物活动稳定。环境温度稳定，反应体系内的各种酶、菌进行生物活性反应；当没有达到反应平衡或发生拮抗作用时，发酵效果就会降低或者减缓。发酵3 d，屎肠球菌制剂＋植物乳杆菌制剂组发酵效果最差，对单宁的降解作用低于空白对照组。研究表明，屎肠球菌的适宜温度范围为25~40 ℃，植物乳杆菌的适宜温度范围为30~35 ℃。原因在于两种菌互相影响，反应体系不稳定，导致30 ℃对单宁降解作用最差。单一菌制剂和酶菌复合制剂发酵效果均优于对照组。张帅等[14]发现，黑曲霉N5-5在30 ℃下产单宁酶效果最好。兰平等[15]发现，青霉和米曲霉在28 ℃时对葡萄皮单宁的降解最好。微生物体系较为活跃时，添加酶制剂可以发挥对单宁的稳定降解作用，与谭思敏等[16]研究单宁酶酶解单宁的脱除效果影响和单宁酶用量的结果一致。3.430 ℃添加高剂量酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽单宁含量的影响饲粮原料中的各种抗营养因子限制了饲料的利用价值。生物发酵处理可以有效去除单宁。李淑颖[17]在黄粱木中接种ST-73，发酵15 d单宁降解效果最好。杨文婷[18]发现，35 ℃下棉酚降解酶对棉酚的降解作用最好。单宁酶属于诱导酶，底物中含有没食子酸，具有产单宁酶特性的微生物就会产生单宁酶与之反应。单宁酶的研究多集中于黑曲霉上。王晓东等[19]发现，霉菌M-6在30 ℃时，产单宁酶活力最高。Chávez-González等[20]在30 ℃下，通过固态发酵和深层发酵对比，发现黑曲霉GH1经固态发酵36~72 h可以检测出鞣酸花，深度发酵则未能检测出鞣酸花。反应体系中的酶添加过量时，酶分子趋于饱和，可能出现酶分子自身水解现象，造成酶对底物的作用减弱，与于海涛等[21]研究一致。当底物中加入酶菌复合制剂后，发酵对单宁的降解作用反而降低，因为30 ℃时菌制剂相对活跃，单一菌制剂可以满足对单宁的降解作用。4结论葡萄籽发酵饲料中添加酶、菌及复合酶菌制剂能够有效降解葡萄籽中单宁含量。本试验条件下，发酵温度为25 ℃时，高剂量的复合菌制剂效果最优；发酵温度为30 ℃时，低剂量的植物乳杆菌制剂组效果最优。