羊肉中富含n-3长链多不饱和脂肪酸（n-3 LCPUFA），包括α-亚麻酸、二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）等。α-亚麻酸是一种必需脂肪酸，能够构成细胞膜、参与酶的合成和维持氨基酸的平衡[1-2]，是合成DHA、EPA的前体物质。研究表明，与天然放牧饲养相比，舍饲饲养的羊其肉中α-亚麻酸及其衍生物等PUFA含量呈下降趋势，饱和脂肪酸含量增加[3]。日粮中添加富含α-亚麻酸的亚麻油可以优化动物体组织中的脂肪酸组成，提高n-3 PUFA的含量，但易在瘤胃中被微生物大量氢化，使其在动物生产中的应用受到限制[4]。棕榈油富含VE和油酸，具有很强的抗氧化能力[5]，通常用于PUFA的保护油脂。课题组前期研究指出，日粮中添加亚麻油对绒山羊肌肉和脂肪等组织中n-3 LCPUFA生成的效率低于亚麻油与棕榈油混合（复配油）添加，机制作用与瘤胃内脂肪酸氢化、肝脏和体组织的脂肪代谢有关[6]。日粮中添加复配油（混合比例为6∶4）可以优化瘤胃发酵功能，增加n-3 PUFA等的含量、添加复配油优化结果优于添加单一棕榈油的优化结果[7]。Zhong等[8]研究发现，使用复配油可以提高动物的生长性能与骨代谢水平。反刍动物瘤胃中脂肪酸的组成与转化受脂肪酸水解与氢化作用的影响，进而影响脂肪酸组成和肉品质[9]。试验以内蒙古白绒山羊为研究对象，利用体外批次培养法，讨论添加不同比例复配油对脂肪代谢相关酶活性、瘤胃微生物数量及营养物质降解的调节作用，为生产中合理使用植物油脂调控羊的脂肪代谢、改善肉品质提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验采用单因素随机试验设计。选择体况健康、体重相近的阿尔巴斯白绒山羊用作瘤胃液的供体羊。供体羊每天8：00和15：00饲喂2次，自由饮水。设6个处理组，每组6个重复。对照组（CON组）底物中不添加油脂，亚麻油组（LSO组）底物中添加亚麻油，棕榈油组（PMO组）底物中添加棕榈油，处理组为亚麻油与棕榈油混合复配油，在底物中分别添加2%不同配比的复配油，亚麻油与棕榈油比例分别为6∶4（LP1组）、5∶5（LP2组）、4∶6（LP3组）。底物日粮精粗比为5∶5。体外培养体系60 mL（瘤胃液与缓冲液配比为1∶2）。体外培养24 h，采集样品。1.2测定指标及方法1.2.1体外培养方法称取精粗比为5∶5的底物1 g，配制Menke缓冲液（不加还原剂），加热至39 ℃，通入一定时间CO2，加入还原剂，继续通CO2直至缓冲液无色。厌氧条件下，加已过滤好的瘤胃液混匀（瘤胃液：缓冲液为1∶2），置于39 ℃恒温水浴锅。装有底物的培养瓶放入水浴锅，通入CO2 30 s，每个培养瓶中添加60 mL人工培养液，盖紧盖子，摇匀，转入温度为39 ℃、速率为120 r/min的恒温气浴摇床中培养24 h。1.2.2测定指标及方法培养结束，测定体外瘤胃营养物质降解率、脂肪代谢相关酶活性和微生物数量。体外营养物质降解率包括干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、Ca及P的降解率。脂肪合成相关酶包括脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、超长链脂肪酸延长酶（ELOVL5）、苹果酸脱氢酶（MDH）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）。脂肪水解相关酶包括激素敏感酯酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）。脂肪酸去饱和相关酶如硬脂酰辅酶A脱氢酶（SCD）、Δ-5脂肪酸脱氢酶（FADS1）、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）等。培养结束，纱布过滤培养液，取1.5~2 mL放入2 mL外旋冻存管中，-80 ℃保存。试验测定的体外瘤胃培养液中的微生物包括总菌（Total bacteria）、蛋白分解丁酸弧菌（B. proteoclasticum）、亨氏丁酸弧菌（B. hungatei）、白色瘤胃球菌（R. albus）和脂解厌氧弧杆菌（Anaerovibrio lipolytica），采用实时荧光定量qPCR法测定。PCR扩增引物见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.001.T001表1PCR扩增引物微生物种类引物序列（5'→3'）退火温度/℃长度/bp文献来源Total bacteria上游ACTCCTACGGGAGGCAG57465孙国平[10]下游GACTACCAGGGTATCTAATCCR.albus上游CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG54175孙国平[10]下游CCTCCTTGCGGTTAGAACAB.proteoclasticum上游CGCCTGCACGAAGCTGGAATC61190自主设计下游CGGCTACCTTGTTACGACTTCACCB.hungatei上游CGCCTGCACGAAGCTGGAATC61190自主设计下游CGGCTACCTTGTTACGACTTCACCAnaerovibrio lipolytica上游AGACACGGCCCAAACTCCTACG60157韩帅[11]下游TCCTCCTTGACCCATTTCCTGA1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行组间数据的多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复配油对绒山羊体外瘤胃培养液中脂肪代谢相关酶活性的影响（见表2）由表2可知，LP1组绒山羊体外瘤胃培养液中的FAS活性显著高于其他各组，LSO组显著高于CON组（P0.05）；LSO组的ACC活性显著高于CON组（P0.05）；LP3组的G6PDH活性显著高于PMO组（P0.05）；各组的MDH、HSL活性均显著高于CON组（P0.05），且各组间无显著差异；LP1组、LP3组的HSL活性显著高于LSO组；LSO组、LP1组的SCD均显著高于CON组与PMO组（P0.05）；CON组、LSO组与复配组的FADS1活性均显著高于PMO组（P0.05）；LSO组的ELOVL5活性显著高于CON组、LP2组和PMO组（P0.05）；LP3组的PDK4活性显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.001.T002表2复配油对绒山羊体外瘤胃培养液中脂肪代谢相关酶活性的影响项目CON组LSO组LP1组LP2组LP3组PMO组SEMP值FAS/(U/mL)367.09c393.32b424.28a383.50bc386.00bc386.21bc7.7600.002 0ACC/(ng/L)44.54b51.92a45.35b45.78b44.85b44.60b1.0300.030 0G6PDH/(μg/L)106.97ab105.32ab100.52b101.23b112.24a98.16b2.5000.020 0MDH/(IU/L)289.70b318.13a319.95a328.93a333.76a318.35a8.0000.019 0HSL/(U/L)247.32c279.54b311.33a286.25ab308.51a283.30ab6.4600.000 4LPL/(μg/L)22.60c26.32ab29.59a25.13bc27.10ab24.77bc0.8300.010 0SCD/(ng/L)194.02c224.61a225.98a217.73ab213.39ab201.00bc5.0400.012 0FADS1/(U/L)4.88a5.13a4.99a4.96a4.93a4.25b0.1300.003 0ELOVL5/(U/L)3.82bc5.19a4.89a3.79bc4.11abc3.57c0.3300.044 0PDK4/(μg/L)0.93b0.99 b0.97b0.96b1.10a0.99b0.0650.019 0注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2复配油对绒山羊体外瘤胃培养液中微生物数量的影响（见表3）由表3可知，与CON组相比，各组瘤胃培养液中的B. proteoclasticum数量均显著降低（P0.05）；LSO组、LP1组、LP2组瘤胃培养液B. hungatei数量显著降低（P0.05）；处理组瘤胃培养液R.albus、Anaerovibrio lipolytica数量均显著升高（P0.05），其他各组间差异均不显著（P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.001.T003表3复配油对绒山羊体外瘤胃培养液中微生物数量的影响项目CON组LSO组LP1组LP2组LP3组PMO组SEMP值Total bacteria20.86a19.86a20.00a20.27a19.84a19.85a0.280.188 0B. proteoclasticum18.89a18.32c18.30c18.47bc18.55bc18.63b0.080.030 0B. hungatei19.14a18.06b17.96b18.21b18.66ab18.70ab0.190.040 0R. albus17.19b18.52a18.80a18.65a18.45a18.40a0.380.004 0Anaerovibrio lipolytica16.99b18.71a18.47a18.35a18.26a18.18a0.290.042 0注：16S rDNA拷贝数为以10为底的对数。lg（拷贝数）/mL2.3复配油对绒山羊体外营养物质降解率的影响（见表4）由表4可知，各组间DM、CP、EE、ADF以及P的消化率均无显著差异（P0.05）；除LP1组外，LSO组、LP2组、LP3组和PMO组的NDF降解率均显著低于CON组，PMO组NDF降解率最低，显著低于LP1组（P0.05）。LSO组与LP1组Ca的降解率显著高于CON组与PMO组（P0.05），且PMO组的Ca的降解率最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.001.T004表4复配油对绒山羊体外营养物质降解率的影响项目CON组LSO组LP1组LP2组LP3组PMO组SEMP值DM59.46a55.54a59.31a56.38a56.34a56.03a1.980.667 0CP55.30a56.95a54.03a52.30a55.88a52.81a3.560.885 0EE75.21a67.98a69.28a57.72a56.80a60.84a5.260.249 0NDF44.68a37.42bc40.26ab37.19bc37.00bc32.82c1.940.030 0ADF30.54a26.72a30.34a28.58a28.34a28.34a2.160.845 0Ca22.23bc31.05a31.51a29.74ab27.21abc21.33c2.260.029 0P54.05a57.53a63.47a49.43a54.10a57.40a3.630.278 0%3讨论3.1复配油对体外瘤胃培养液中脂肪代谢相关酶活性的影响动物机体中脂肪代谢的过程包括消化吸收、分解、氢化和合成过程。α-亚麻酸是合成n-3多不饱和脂肪酸的前体。Li等[12]发现，给羔羊饲喂亚麻籽可以促进多不饱和脂肪酸代谢相关基因的表达。FAS活性可以影响动物机体的脂肪含量[13]。Hundahl等[14]研究发现，HSL是脂质分解代谢的关键酶。Mulder等[15]研究发现，HSL对脂肪水解具有限速作用。张秋旭等[16]研究发现，日粮中添加亚麻油可以提高羊肉胴体中PUFA的含量，可使LPL的含量增加。Rogowski等[17]研究发现，SCD可以将饱和脂肪酸转化成单不饱和脂肪酸。瘤胃内脂肪浓度的升高或摄入过多的脂肪，FAS、ACC活性均会增加[18]。亚麻油富含C18∶3n3等多不饱和脂肪酸，棕榈油中富含C18∶1n9c等单不饱和脂肪酸。当机体中与脂肪酸去饱和脂肪酸延长FADS1和ELOVL5活性上升时，有助于EPA和DHA的沉积[19]。Wang等[20]研究发现，动物机体摄入亚麻籽可以增加ELOVL5和FADS2的表达。本试验中，LSO组的FAS、HSL、LPL、SCD和ELOVL5活性显著高于CON组，说明亚麻油可以加速脂肪的水解，可以生成更多的n-3 PUFA；棕榈油部分代替亚麻油，日粮中的C18∶3n3含量减少，对脂类物质的代谢无显著影响，但有的酶活性升高会促进n-3 PUFA的生成。此结果证实了课题组前期研究的成果，日粮中添加亚麻油与棕榈油的混合油，通过改变瘤胃液中脂类代谢有关的酶活性，增加瘤胃液中C18∶3n3含量，引起血液与体组织中n-3 PUFA升高。ACC是长链脂肪酸从头合成的限速酶[21]。添加单一的亚麻油，ACC活性显著高于LP1组，表明添加单一亚麻油可以促进瘤胃内FA的从头合成。G6PDH、MDH和PDK4在脂肪酸的从头合成过程中，为其提供能量。本试验中，大部分混合油组的上述酶活性均无显著差异，但MDH活性高于CON组，说明添加油脂可以促进脂肪酸的合成。3.2复配油对体外瘤胃培养液中瘤胃微生物数量的影响瘤胃中脂肪代谢相关的微生物与脂肪酸含量及氢键的含量有很强的关联，微生物对不饱和脂肪酸的氢化具有一定的作用，瘤胃中含有大量的PUFA会使动物中毒，进而影响瘤胃微生物的生长，毒性从强到弱分别为C20∶5n3、C22∶6n3、亚麻酸和亚油酸[22]。当动物摄入过多的不饱和脂肪酸时，与脂肪代谢相关的微生物可以通过氢化脂肪酸来保护自身[23]。氢化脂肪酸的微生物可以分为两组，分别作用于不同的代谢过程[24]。C18∶3n3和C18∶2n6可被R. albus氢化，转化为反式十八碳脂肪酸；B. proteoclasticum、B. hungate是瘤胃中十八碳不饱和脂肪酸的主要氢化微生物，可以将反式C18∶1转变为C18∶0，这些微生物均易受到脂肪酸种类与组成的影响[25]。Vargas等[26]研究发现，反刍动物饲料中添加亚麻油会引起瘤胃微生物区系的改变和瘤胃脂肪酸的加氢。动物的日粮中添加亚油酸，瘤胃中微生物菌群的数量及丰度会有下降，含油脂多的日粮会降低瘤胃内原虫及纤维降解菌数量[27]。生物氢化的前提是瘤胃中脂肪的降解，Anaerovibrio lipolytica主要的作用是降解甘油三酯，通过16S rRNA测序技术发现其在瘤胃中的丰度约占0.05%[28-29]。研究表明，瘤胃中含有过多的不饱和脂肪酸时，Anaerovibrio lipolytica的数量能够处于一个相对较高的水平，该微生物对不饱和脂肪酸的耐受性较大[2]。杨舒黎[30]研究表明，日粮中添加亚麻油后可以使瘤胃中Anaerovibrio lipolytica含量升高。本试验也得出类似的结果，油脂进入瘤胃中，需要进一步分解为脂肪酸才能够为动物所利用。因此，需要大量的Anaerovibrio lipolytica来分解油脂，其对过多的PUFA的毒性耐受性高，添加油脂后明显提高该菌的数量。添加油脂的各组B. proteoclasticum和B. hungatei数量显著低于CON组，降低了氢化作用；但R.albus的数量则显著高于CON组，氢化过程加强，说明添加油脂对脂肪酸的氢化作用的影响与瘤胃液中脂肪酸浓度有关。3.3复配油对体外营养物质降解率的影响Hassanat等[31]研究发现，奶牛日粮中添加亚麻油对干物质采食量和纤维的表观消化率无明显影响。Adeyemi等[32]研究发现，棕榈油和菜籽油混合添加在山羊日粮中，对营养物质的消化率无明显影响。研究发现，奶牛日粮中添加橡胶籽油和亚麻油的混合油能够提高干物质和中性洗涤纤维的消化率[33]。日粮中添加不同形式亚麻油能够提高肉羊试验末重，提高日粮中Ca、P、EE的消化率[34]。本试验中，DM、CP、EE、ADF、P的消化率，在CON组和各处理组间无显著差异。Griel等[35]研究发现，多不饱和脂肪酸的摄入对骨骼强度有促进作用。本试验中，LSO组与LP1组的Ca消化率显著高于CON组，与上述研究相同。4结论添加单一亚麻油或添加以6∶4混合的亚麻油与棕榈油均可增强瘤胃内脂类分解代谢有关的酶、脂肪酸延长及去饱和有关的酶的活性；添加单一亚麻油或棕榈油均可降低NDF的体外瘤胃降解率，6∶4混合的亚麻油与棕榈油可以降低油脂对NDF降解率的抑制作用。