不可降解的石化基材料在工业生产和日常生活中广泛应用，成为“白色污染”的根源[1]。生物可降解塑料因其优异生物相容性、生物可降解性等，作为传统石油化工塑料的替代品具有重要研究意义[2]。聚乳酸(PLA)由可再生生物质乳酸合成，产量大、应用范围广，具有生物降解及生物循环的特性，能够被环境中的微生物降解生成CO2和水，目前广泛应用于医药、生物技术、农业、包装、电子电器产品及交通运输等领域[3]。但PLA的生物降解通常比其他有机废物的降解速率慢[4-6]。Richert等[7]研究PLA在海水或河水中的降解实验，结果表明：PLA材料在自然环境中性质稳定，降解速率缓慢，需要几年才能够被完全降解。目前，针对PLA材料的降解研究多数加入微生物，包括堆肥法和液体培养法[8-11]。但堆肥法成分不明确，难以对PLA的降解特性进行探索，难以明确降解条件，且实验可控性、可重复性较差，通常采取液体培养法优化降解条件。自然界中存在能够降解甚至完全降解PLA的微生物，例如放线菌、假诺卡氏菌、假单胞菌、芽孢杆菌及真菌Tritirachium album等。林娟等[10]筛选一株放线菌Lentzea waywayandensis，蛋白酶活约为7.8 U/mL，优化培养后PLA在25 d后质量损失84.8%。贾昊等[11]筛选门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina，优化得到其蛋白酶活性最高为32.15 U/mL，可以有效降解PLA。PLA降解过程是在大分子酶影响下发生，虽然PLA属于脂肪类聚酯，但已知的PLA降解酶大部分为蛋白酶类[12-13]。Williams[14]在1981年首次报道来源Tritirachium album的蛋白酶K对PLA具有降解作用。巨大芽孢杆菌[15]、枯草芽孢杆菌[16]及解淀粉芽孢杆菌[17]可以分泌胞外蛋白酶。本实验将巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌应用于PLA降解，研究其产蛋白酶的能力以及对PLA的降解特性。探索不同诱导物的种类、浓度对PLA降解过程、降解特性的影响，以提高PLA降解效率，并为PLA的生物降解提供技术支持。1实验部分1.1主要原料聚乳酸薄膜(PLA)，珠海金发生物材料有限公司；聚乳酸母粒(PLA)，4032D，美国Nature works公司；巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，山东绿陇生物科技有限公司；福林酚试剂，AR、酪氨酸，HPLC，北京索莱宝科技有限公司；三氟乙酸、无水碳酸钠，AR，上海麦克林生化科技有限公司；明胶，CP，国药集团化学试剂有限公司；酸水解酪蛋白，BR，上海士锋生物科技有限公司；酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨，BR，北京奥博星生物技术有限责任公司。1.2仪器与设备自动高压灭菌器，SX-500，日本Tomy Digital Biology 公司；电热恒温培养箱，DNP-9082，上海精宏实验设备有限公司；冷冻离心机，Z326K，德国HERMLE Labortechnlk GmbH公司；医用离心机，H1650-W，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；全波长酶标仪，Multiskan GO-1510，美国Thermo Fisher Scientific公司；超高分辨热场发射扫描电镜(SEM)，JSM-7800F，日本电子株式会社；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)，Spectrum two，铂金埃尔默仪器有限公司。1.3样品制备1.3.1培养基脱脂牛乳平板(g/L)：脱脂乳粉为40.0、琼脂粉为20.0、pH自然。纯化培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0、琼脂粉20.0、pH值自然。基础培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0、pH值自然。无机盐培养基(g/L)：CaCl2‧2H2O 0.020、MgSO4‧7H2O 0.20、NaCl 0.10、FeSO4‧H2O 0.010、Na2MoO4‧2H2O 0.000 5、Na2WO4‧2H2O 0.000 5、MnSO4 0.5 mg、(NH4)2SO4 1.0、pH值自然。诱导培养基(g/L)：PLA母粒作为唯一碳源的无机盐培养基，添加不同种类及不同浓度的诱导物。降解培养基(g/L)：PLA薄膜作为唯一碳源的无机盐培养基，诱导物为1%酵母浸粉。1.3.2菌株的纯化及种子液的制备将微生物菌剂溶于无菌生理盐水配置菌悬液，划线接种于纯化培养基，37 ℃中培养24 h。经两次纯化，挑取单菌落接入基础培养基液体培养，连续培养两次得到种子液。1.4性能测试与表征菌株产蛋白酶能力测试：采用牛津杯双层平板琼脂扩散法[18]测定芽孢杆菌的产蛋白酶能力，将种子液分别接种于脱脂牛乳平板上，37 ℃恒温培养48 h，观察平板上水解透明圈。菌株产蛋白酶条件优化：PLA母粒为唯一碳源，探究明胶、酸水解酪蛋白、酵母浸粉、胰蛋白胨和大豆蛋白胨等不同诱导物，0~2%酵母浸粉不同浓度对菌株蛋白酶活的影响，pH值为8.0，35 ℃，150 r/min于恒温摇床中培养120 h，OD600 nm处测量菌体生长浓度，低温离心得到粗酶液，测定蛋白酶活性，确定诱导物及其最适浓度。PLA母粒为唯一碳源，添加1%酵母浸粉作为诱导物，探究初始pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培养时间为1、2、3、4、5d及种子液接种量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的培养条件对菌株蛋白酶活的影响，OD600 nm处测量菌体生长浓度，低温离心得到粗酶液，测定蛋白酶活性，同时设置不接种菌株及不添加碳源作为空白对照。PLA薄膜降解性能测试：PLA薄膜(20 mm×20 mm)为唯一碳源培养基，加入1%酵母浸粉，调节初始pH值为8.0，接种2%(V/V)种子液，同时设置不接种菌株及不添加碳源作为空白对照组。35 ℃，150 r/min于恒温摇床中降解5 d，每隔24 h于OD600 nm处测定菌体生长浓度、粗酶液的蛋白酶活性及PLA薄膜的质量损失。菌体生长浓度测试：采用全波长酶标仪，测定培养液在OD600 nm处的吸光度。蛋白酶活性测试：采用福林酚法[19]测定蛋白酶活性。一个单位的蛋白酶活性(U/mL)为在40 ℃、pH值为8.0的条件下，1 mL上清液中水解酪蛋白产生1 µg/min酪氨酸的酶量。失重率测试：将PLA薄膜裁剪至约20 mm×20 mm，50 ℃烘干4 h, 准确称取质量为M0的PLA薄膜。降解实验结束时，倾出培养液，过滤收集残留PLA薄膜、超声清洗、50 ℃烘干 4 h后准确称重M1，计算PLA薄膜失重率。SEM分析：对降解前后PLA薄膜表面喷金处理，10 kV加速电压下，观察样品表面形貌。FTIR分析：对降解前后PLA薄膜的结构进行全衰减反射模式(ATR-FTIR)扫描，波长范围为400~4 000 cm-1。2结果与分析2.1菌株产PLA降解酶的初步分析图1为芽孢杆菌产胞外蛋白酶的水解圈。从图1可以看出，37 ℃恒温培养48 h后，脱脂牛乳平板上均出现透明圈，初步判断巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌均可以产生胞外蛋白酶，枯草芽孢杆菌没有形成较为明显的透明圈，巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的水解透明圈较枯草芽孢杆菌更显著，说明巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌产胞外蛋白酶的能力更强。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F001图1芽孢杆菌产胞外蛋白酶的水解圈Fig.1Hydrolysis circle of extracellular protease produced by Bacillus2.2诱导物对芽孢杆菌菌体生长及蛋白酶活性的影响材料降解初期，微生物先分泌胞外蛋白酶，酵母浸粉、酸水解酪蛋白、蛋白胨或明胶等物质，可以提供降解前期菌体生长的必要营养，与PLA的L-乳酸单元有类似的L-丙氨酸单元，添加此类诱导物能够诱导微生物产生更多的蛋白酶[20]。图2为不同诱导物的种类和浓度对菌株生长及蛋白酶活性的影响。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F002图2诱导物对菌株生长及蛋白酶活性的影响Fig.2The influence of inducer on the growth and protease activity of the bacterium从图2a可看出，诱导物的添加对菌株的菌体浓度产生正向积极影响，酵母浸粉对巨大芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的菌体生长影响最显著，枯草芽孢杆菌在酸水解酪蛋白的影响下菌体浓度最高。从图2b可以看出，酵母浸粉作为诱导物，对于巨大芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌影响显著，巨大芽孢杆菌的最高蛋白酶活性约为23.79 U/mL，解淀粉芽孢杆菌的最高蛋白酶活性约为21.23 U/mL。酸水解酪蛋白及酵母浸粉用于枯草芽孢杆菌时产生的影响无显著差别，蛋白酶活性分别为11.61 U/mL和11.05 U/mL。诱导物的适量添加促使菌体生长迅速及蛋白酶活增加的原因可能是在菌种降解PLA前期，菌体需要快速生长繁殖并分泌蛋白酶，但PLA在培养初期很难被直接利用，菌体生长前期缺乏营养；而诱导物的加入，能够提供菌体初期生长所需营养，还能够诱导菌体产生更多的蛋白酶，蛋白酶攻击PLA的酯键，产生寡聚体、二聚体和单体，这些低分子量化合物可以被微生物吸收转化为二氧化碳和水。从图2c和图2d可以看出，当酵母浸粉添加量达到1%，增加酵母粉的浓度对于菌体的生长及蛋白酶活性影响小。液体培养基内菌体生长均达到平衡，初期添加更多的营养虽然有利于菌株菌体生长，提高蛋白酶活性，但无法全部被菌体利用。从成本角度考虑，选取1%的酵母浸粉进行后续研究。2.3培养条件对菌体生长、蛋白酶活性及PLA降解的影响PLA的降解速率不仅取决于自身的物理化学性质，pH值、温度、时间和菌体接种量等条件对微生物的产酶能力及蛋白酶的活性产生一定的影响[21]。图3为培养条件对菌体生长及蛋白酶活性的影响。从图3a和图3b可以看出，菌种的接种量由1% (V/V)增至3% (V/V)，菌体浓度与蛋白酶活性没有呈现增加的趋势。接种量超过2% (V/V)时，菌体浓度与蛋白酶活性出现下降趋势。原因可能是液体培养基中添加的营养物质有限，增加菌种接种量后营养不足，因此菌体浓度及蛋白酶活性没有随之增加。从图3c和图3d可以看出，初始pH值由7.0增至9.0，菌体浓度持续增加，蛋白酶活性也持续增加。原因有可能是PLA降解产生小分子乳酸，致使培养基的pH减小，初始pH越高，降解PLA后，随着乳酸的增加pH值仍为碱性，有利于碱性蛋白酶维持自身活性，因此粗酶液酶活持续增加。从图3e和图3f可以看出，随着培养时间的增加，菌体浓度随之增加，蛋白酶活性在0~48 h时快速增加，培养至96 h增加平缓。原因可能是培养后期培养基内营养耗尽，菌体营养摄入不足，菌体进入凋亡期大量死亡，分泌的蛋白酶减少，酶活基本保持不变。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F003图3培养条件对菌体生长及蛋白酶活性的影响Fig.3The influence of culture conditions on the growth and protease activity of the bacterium图4为培养条件对PLA降解率的影响。从图4可以看出，三种芽孢杆菌中，巨大芽孢杆菌分泌的蛋白酶对于PLA的降解更有效，当pH值为8.0，对于PLA的降解效果最好。原因可能是PLA在碱性环境下降解更好。接种量为2% (V/V)时，降解效果最好，此时培养基中的营养成分足够满足菌体生长的需要，菌体生长与所处环境达到平衡，更有利于菌体分泌蛋白酶，攻击酯键降解PLA。随着降解的进行，PLA降解率增加，酶在该条件下能够保持自身活性，可以持续降解PLA。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F004图4培养条件对PLA降解率的影响Fig.4Effect of culture conditions on PLA degradation rate2.4巨大芽孢杆菌应用于PLA膜降解的特性研究2.4.1PLA薄膜降解过程中的参数分析图5为PLA薄膜降解过程中的微生物菌体生长、蛋白酶活性及PLA薄膜降解率。从图5a可以看出，降解5 d后，微生物菌体生长持续增加。从图5b可以看出，降解4 d后,蛋白酶活性最高，达到26.73 U/mL；降解5 d后，酶活降低至25.33 U/mL。可能是因为环境中乳酸增加，pH值降低，蛋白酶部分失活。从图5c可以看出，未加巨大芽孢杆菌的空白对照组，PLA仅发生缓慢水解[22]。巨大芽孢杆菌参与降解后，PLA的降解率明显增加，经过5 d降解后，降解率达到20.96%。降解前期，酶作为大分子，对材料内部的渗透有限，降解缓慢。随着PLA的缓慢水解以及蛋白酶攻击酯键的双重作用，产生寡聚体、二聚体以及单体，加快PLA薄膜的降解速率[23]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F005图5巨大芽孢杆菌应用于PLA降解Fig.5Bacillus megaterium applied to PLA degradation2.4.2PLA薄膜降解前后的SEM分析图6为PLA薄膜降解前后的表面形貌变化。从图6a可以看出，降解前薄膜表面光滑。从图6b可以看出，生物降解5 d后，未加菌的液体培养环境中薄膜表面轻微粗糙，PLA薄膜发生部分水解，但水解作用缓慢。从图6c可以看出，生物降解5 d后，添加巨大芽孢杆菌的液体培养环境中薄膜表面由无色透明逐渐变成白色，出现细微颗粒型小泡，由于微生物的黏附和代谢作用，PLA薄膜变脆[11]，巨大芽孢杆菌能够在薄膜表面生长，放大倍数观察到薄膜出现轻微裂痕。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F006图6PLA膜降解前、未加菌以及巨大芽孢杆菌降解5 d后SEM照片Fig.6SEM images of PLA film before degradation， after degradation for 5 d without Bacillus megaterium and with Bacillus megaterium2.4.3PLA膜降解前后的FTIR分析图7为降解前后PLA的FTIR谱图。从图7可以看出，1 180 cm-1处为PLA的C—O—C的伸缩振动，1 080 cm-1 处为C—O的对称伸缩振动，1 748 cm-1处的峰为C=O伸缩振动的吸收峰，3 503 cm-1处为—OH的伸缩振动。PLA薄膜在降解5 d后，在未接种巨大芽孢杆菌的空白对照组中，PLA的特征峰变化不明显；加入巨大芽孢杆菌降解PLA薄膜后，3 200~3 600 cm-1产生较宽较强的吸收峰。原因可能是蛋白酶攻击聚合物分子链上的酯键，PLA分子链断裂，降解为寡聚体及乳酸等小分子产物[11]，产生羟基，吸收峰偏向低频[24]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.02.017.F007图7PLA降解前后的FTIR谱图Fig.7FTIR spectra before and after PLA degradation3结论（1）巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌均可以产生胞外蛋白酶，添加诱导物后蛋白酶活性均有提高。（2）三种芽孢杆菌中对PLA降解最有效的是巨大芽孢杆菌，在1%酵母粉作为诱导物的营养条件下，蛋白酶活性最高，可达23.79 U/mL。（3）菌种分泌的蛋白酶通过攻击PLA酯键使其断裂，5 d后降解率可达20.96%，筛选可快速降解PLA的菌株，为实验室条件下生物降解PLA的研究提供理论依据和技术支持，扩大其在工农业和医学领域以及日常生活的应用。