奶牛隐性乳房炎（diary cow subclinical mastitis）是奶牛养殖过程中的常见疾病[1-3]。奶牛隐性乳房炎无明显临床症状，发病隐蔽不易察觉，但此时乳区内体细胞数已明显升高，对乳品质和产量影响巨大，是制约乳产业健康发展的重要疾病之一[4-9]。隐性乳房炎病因众多，机械刺激、遗传因素、营养因素均可诱发该病，其中，病原微生物感染是最主要的病因之一[10-11]。目前，针对病原菌感染使用抗生素仍是兽医临床治疗奶牛隐性乳房炎的首选方法，但随着抗菌药物不断使用，病原菌耐药性也逐渐增强，不仅加大了疾病治疗难度，也增加了动物性食品抗生素残留的风险[12-13]。本研究对抚顺某规模化奶牛养殖场隐性乳房炎患病情况进行流行病学调查，同时对其主要病原菌进行分离鉴定，评估病原菌分离株的耐药性水平，为该场奶牛隐性乳房炎治疗提供帮助。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源试验于抚顺某规模化奶牛养殖场进行样品采集，选取临床表现正常、乳区泌乳功能良好、乳汁性状正常的泌乳期奶牛600头。1.1.2主要仪器LS-35LD立式蒸汽高压灭菌器（上海力辰仪器科技有限公司）、HSP80B恒温振荡生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SDD-60KD恒温隔水式培养箱（绍兴苏珀一起有限公司）、SJ-3084S无菌工作台（苏州净化设备有限公司）、200 μL F3移液器（北京赛默飞世尔科技）。1.1.3主要试剂普通固体营养琼脂培养基、普通营养肉汤培养基、麦康凯琼脂粉，均购自青岛海博生物技术有限公司；高盐甘露醇培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄球菌属细菌生化鉴定管、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；抗菌药物药敏纸片（20种）购自杭州微生物试剂有限公司；奶牛隐性乳房炎检测液（兰州利拉伐CMT套装）由饲养场提供。1.2试验方法1.2.1隐性乳房炎筛查采样奶牛适当保定，对4个乳区进行碘酊-酒精-碘酊的消毒步骤。每个乳区弃去头3把奶，分别挤5~10 mL乳样至CMT检测摇盘。每个摇盘中分别加入等量的CMT检测液，水平方向轻摇3~5圈后静置，观察颜色变化。采集隐性乳房炎乳区的乳样10~15 mL于灭菌离心管，标记好的离心管置于4 ℃样品冷藏保存盒，尽快送至实验室。1.2.2病原菌初步分离按照产品说明书要求，配制普通固体营养琼脂培养基、普通营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基。将配制好的培养基经37 ℃恒温培养箱过夜检菌，检菌合格的培养基4 ℃密封保存。取100 μL隐性乳房炎乳样，均匀涂布于普通营养琼脂培养基，正置于无菌工作台中片刻，待乳样充分吸收后倒置，37 ℃恒温培养12 h。在培养后的琼脂平板中挑取菌落形态、生长形状不同的单独菌落，分别接种于普通营养肉汤培养基中，37 ℃ 180 r/min培养12 h，标记后于终浓度为30%的甘油中-80 ℃保存、待检。取待检甘油菌，分别涂布于麦康凯琼脂平板和高盐甘露醇琼脂平板中，同普通琼脂平板培养条件，对病原菌进行初步分离[10]。1.2.3病原菌生化反应鉴定在麦康凯琼脂平板中选取圆形、具有红色金属光泽的典型菌落；在高盐甘露醇琼脂平板中选取圆形、淡黄色、菌落周围呈明显黄色的针尖状菌落，分别采用肠杆菌科细菌生化鉴定管和葡萄球菌属细菌生化鉴定管，对其进行生化反应鉴定。将细菌接种于微量鉴定管后，加入1滴液体石蜡封闭鉴定管，37 ℃恒温封口培养过夜。观察反应管颜色变化，并根据细菌编码手册对病原菌进行赋码、鉴定。1.2.4病原分离株药敏试验将鉴定后的主要病原菌分离株均匀涂布于90 mm固体琼脂平皿中，待菌液吸收后将药敏纸片均匀放置于平皿内，药敏纸片间预留足够距离以便测量抑菌环直径。平皿37 ℃恒温培养12 h，游标卡尺测量抑菌环直径，取3次测量结果的平均值为该药物对病原菌分离株的抑菌直径，并与参考值进行比较，评估病原分离株对药物的敏感性。2结果与分析2.1隐性乳房炎筛查结果在该场调查的600头奶牛2 400个乳区中，发现28头为隐性乳房炎阳性病牛，患病乳区47个。该场奶牛隐性乳房炎患病率为4.67%，乳区阳性率为1.96%。2.2隐性乳房炎病原菌分离鉴定结果（见图1）由图1可知，阳性病料经麦康凯及高盐甘露醇鉴别培养基，初步分离到疑似肠杆菌科分离株56株、葡萄球菌属分离株63株。上述病原菌分离株经生化反应鉴定、编码对比，最终确定病原菌76株，其中大肠杆菌分离株31株、金黄色葡萄球菌38株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌1株。该场奶牛隐性乳房炎主要病原菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，占比分别为50%（38/76）及40.8%（31/76）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.013.F001图1隐性乳房炎病原菌分离鉴定结果Fig.1Pathogenic bacteria isolation and identification result of subclinical mastitis2.3隐性乳房炎主要病原菌耐药性结果（见表1）对本试验分离到的38株金黄色葡萄球菌及31株大肠杆菌分离株进行药敏纸片抑菌试验，结果表明，2种病原菌对受试的临床常用20种抗生素均产生不同程度的耐药性。由表1可知，金黄色葡萄球菌分离株对磺胺类药物的复方新诺明和磺胺甲基异恶唑耐药率较高，分别为71.1%及57.9%；其他耐药率相对较高的药物为庆大霉素、四环素及链霉素，耐药率分别为52.6%、47.4%及44.7%。金黄色葡萄球菌对头孢菌素类及青霉素类药物敏感性相对较高，尤其是头孢菌素类，头孢拉定和头孢曲松各仅有1株（2.6%）分离株对其耐药。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.013.T001表1隐性乳房炎主要病原菌耐药性结果Tab.1Antibiotics resistance result of major pathogenic bacteria isolated from subclinical mastitis类别名称金黄色葡萄球菌大肠杆菌耐药数/株中介数/株敏感数/株耐药率/%耐药数/株中介数/株敏感数/株耐药率/%青霉素类氨苄西林6102215.81331541.9青霉素982123.7252480.6头孢菌素类头孢拉定12352.637219.7头孢曲松10372.629206.5大环内酯类红霉素1371834.2253380.6阿奇霉素1532039.5193961.3四环素类四环素1871347.4168751.6多西环素11111628.9221871.0磺胺类复方新诺明274771.1282190.3磺胺甲基异恶唑2251157.9300196.8喹诺酮类恩诺沙星1202631.6197561.3环丙沙星8111921.1186758.1氧氟沙星962323.7211967.7氨基糖苷类链霉素1731844.7167851.6庆大霉素2012652.6220971.0丁胺卡那672515.81811258.1卡那霉素882221.1271387.1大观霉素314217.9221871.0新霉素1361934.2179554.8林可胺类林可霉素533013.2941829.0在31株大肠杆菌分离株中，绝大多数分离株对受试药物均表现较高的耐药性，如对复方新诺明、磺胺甲基异恶唑、卡那霉素、青霉素及红霉素均表现高度耐药，耐药率分别为90.3%（28/31）、96.8%（30/31）、87.1%（27/31）、80.6%（25/31）及80.6%（25/31）。大肠杆菌仅对头孢菌素类药物敏感，对头孢拉定及头孢曲松敏感率为67.7%（21/31）及64.5%（20/31）。对病原菌分离株进行多药耐药分析，结果显示，65.8%（25/38）的金黄色葡萄球菌及77.4%（24/31）的大肠杆菌分离株为多药耐药菌株（同时耐受至少3类抗菌药物）。在金黄色葡萄球菌中，同时耐受4类药物的分离株占比最高，为42.1%（16/38）；在大肠杆菌中，同时耐受5类药物的分离株占比最高，为35.5%（11/31）。在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中均有分离株耐受所有种类受试药物。3讨论奶牛隐性乳房炎具有隐蔽性强、流行范围广的特点，对奶牛养殖业及乳产业造成了严重的经济损失。目前，抗生素疗法是临床治疗隐性乳房炎的首选方案，但随着药物的不断使用，病原菌在抗生素的选择压力作用下逐渐产生耐药性，给临床疾病治疗和动物性食品安全带来挑战。因此，对奶牛隐性乳房炎展开流行病学调查及病原耐药性研究意义重大。本研究对辽宁抚顺某规模化奶牛养殖场进行隐性乳房炎病原耐药性研究，结果表明，该场奶牛隐性型乳房炎患病率为4.67%、乳区阳性率为1.96%，与其他地区报道数据相比患病率相对较低。王勇民[7]报道，河南地区规模化和散养户奶牛隐性乳房炎发病率分别为45.3%和57.1%。吕倩等[8]报道，四川地区奶牛隐性乳房炎总发阳性率为19.0%。韩晓霞等[9]报道，陕西地区规模化奶牛养殖场隐性乳房炎发病率为10.6%。马博等[2]报道，新疆地区随机抽样检测奶牛隐性乳房炎患病率为24%。刘霄等[11]报道，昆明地区规模化奶牛养殖场隐性乳房炎阳性率为28.79%、散养户阳性率为56.21%。李艳菊等[13]报道，天山北坡奶牛隐性乳房炎总体患病率为21.0%，且高产奶牛发病率显著低于低产奶牛。杨兴斌[14]报道，甘肃地区奶牛隐性乳房炎患病率为49.17%，且阴性乳房炎患病率与奶牛胎次呈明显正相关。与报道数据相比，本研究中奶牛养殖场隐性乳房炎阳性率相对较低，可能与该场日常饲养管理因素有关。养殖场能够经常对奶牛进行体细胞计数检测、CMT日常筛查等，可尽早发现阳性病例并进行积极干预。本研究对分离到的主要病原菌（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）进行药物敏感性测试。结果表明，两种病原菌分离株对磺胺类药物均表现较高的耐药性，对其他受试药物也表现出不同程度的耐受；两种病原菌分离株均对头孢菌素类药物较为敏感。马博等[2]报道，新疆地区阴性乳房炎金黄色葡萄球菌对青霉素、链霉素、环丙沙星耐药率为100%，对阿莫西林耐药率为80.8%、对庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、头孢氨苄耐药率为5.7%，对多西环素、克林霉素、四环素耐药率为0。邓凯伟等[4]报道，信阳地区隐性乳房炎大肠杆菌对万古霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因高度敏感，对红霉素中度敏感，对克林霉素、克拉霉素、米诺环素、复方新诺明低度敏感，对大观霉素、四环素、青霉素G、苯唑西林、多黏菌素B耐药。李希强等[15]报道，内蒙古地区隐性乳房炎金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对庆大霉素、美罗培南、环丙沙星、磷霉素敏感，对四环素、头孢他啶、氟苯尼考耐药性较高。本研究结果与上述结论中耐药性、耐药谱等方面存在差异，可能是由于地理位置及日常治疗用药方案等不同所致。4结论对病原菌分离株多药耐药情况分析发现，本研究得到的分离株均表现出较为严重的多药耐药现象，42.1%的金黄色葡萄球菌同时耐受4类药物，35.5%的大肠杆菌同时耐受5类药物。耐药性菌株，特别是多药耐药菌株的大量存在，可对疾病治疗及预防造成严重威胁。建议该场根据研究结果合理制定治疗方案。