羊痘（capripoxvirus disease）是由羊痘病毒引起一种羊口腔、唇部、乳房等部位出现痘疹的急性、烈性传染病[1-2]。羊痘发病率高，羔羊感染率达到100%，病死率可达80%；成年羊病死率相对较低，但可引发其他病原微生物的感染[3-4]。羊痘在世界各地广泛流行，羊痘病毒对我国的危害较为严重，尤其是在养羊业发达的地区，可对我国养殖业造成巨大的经济损失[2]。山羊痘病毒是在胞质内复制的双链DNA病毒，电镜下可观察到卵圆形或砖形颗粒，大小约194~200 nm[5-8]，基因组中含有147个开放式阅读框（open reading frame，ORFs），分为核心编码区和侧翼区。核心编码区参与病毒复制、细胞内成熟和细胞外包膜病毒体构成和组装、RNA修饰和病毒的转录[9]，而侧翼区主要与病毒的毒力和宿主免疫逃避有关。转录因子是一种特殊的蛋白质，能够调控基因、表达相关的功能蛋白，与启动子中顺式作用原件相互结合的DNA蛋白[10-12]。基因的前段含有转录因子（transcription factor，TF）的结合位点，与转录因子DNA结合后对基因的表达具有一定的作用[13-17]。晚转录因子（VLTF）是生化反应后期起理化作用的转录因子。羊痘病毒含有4个晚期转录因子，其中两个中期转录因子VLTF-3（GTPV-099、115）均位于病毒的核心区。因此，转录因子在病毒转录复制过程中意义重大。本研究构建了VLTF-1的原核表达载体并进行了蛋白表达，为进一步了解羊痘病毒晚转录因子１（VLTF-1）的生物学特性，系统研究羊痘病毒的转录机制和转录因子的功能、特性提供参考。1材料与方法1.1试验材料山羊痘病毒SS株、原核表达的DH5α、BL21感受态细胞，保存于塔里木畜牧科技重点实验室。1.2试剂与仪器主要试剂：PCR Mix（纽英仑生物科技公司）、Prime STAR聚合酶（大连宝生物科技公司）；EcoR1、Xho Ι等限制性内切酶以及dNTPs、PCR试剂（Thermo生物科技公司）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒（OMEGA生物科技有限公司）等。主要仪器：干式恒温箱（杭州奥盛仪器有限公司）、DK-8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、伯乐T100梯度PCR仪（北京智杰方远有限公司）、凝胶成像分析系统（ChemiDoc XRS）。1.3试验方法1.3.1引物设计根据GenBank上发表的山羊痘病毒Pellor株（登录号：NC-004003.1）的基因序列，利用DNAstare软件对VLTF-1基因设计一对合理的、特异性强的引物。为便于载体构建，在引物５'端添加酶切切位（划线处）；引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物合成信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.T001表1引物合成Tab.1Primer synthesis table名称引物序列(5'→3')片段大小/bpVLTF-1 FGGAATTCCATATGAGTCTTCGTATAAAAATAG783VLTF-1 RCCGCTCGAGATCGTGGAACGCCATA1.3.2羊痘病毒SS基因组的提取取2 cm2的病料、5 mL维持液、0.5 mL青霉素、0.5 mL链霉素和适量高压灭菌的石英砂，充分研磨病料后４ ℃保存过夜，4 000 r/min离心5min。取200~300 μL按照Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒说明书提取DNA，检测浓度。1.3.3目的基因PCR扩增及回收以提取羊痘病毒SS株的基因组为模板，以特异VLTF-1F、VLTF-1R和primer star聚合酶扩增目的基因。PCR反应体系为（25 μL）：模板1 μL、引物F 0.5 μL、引物R 0.5 μL、buffer 5 μL、dNTP 1 μL、 prime star酶1μL、ddH2O 16 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40个循环。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因。1.3.4原核表达载体的构建1.3.4.1酶切将回收的VLTF-1基因片段和pET42b载体利用NdeⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切。50 μL酶切体系为：VLTF-1基因片段（载体）25 μL、1×Buffer 5 μL、NdeⅠ 2 μL、XhoⅠ 2 μL、ddH2O 16 μL。混匀后放入37℃水浴锅中酶切3 h，酶切的片段和pET42b载体切胶回收。1.3.4.2连接在PCR管中加入酶切回收的7.5 μL VLTF-1基因和1 μL 载体，加入0.5 μL T4连接酶、1 μL 10×Buffer混匀，16 ℃水浴过夜。1.3.4.3转化与鉴定将连接的质粒转入已经制备好的感受态细胞DH5α中，在含有氨苄西林（amoxicillin，AMP）抗性的LB平板37 ℃培养16 h，挑取单个菌落利用PCR鉴定。鉴定成功后，提取大量质粒酶切鉴定。提取的质粒送生工生物工程股份有限公司做测序鉴定，测序结果采用DNAstar软件进行序列和遗传进化分析。1.3.5VLTF-1的原核表达经鉴定阳性的原核表达载体转化BL21感受态细胞，挑取单菌落含有AMP抗性的LB平板培养皿，采用0.1 mmol/L IPTG进行诱导表达，12 000 r/min离心3 min去上清，沉淀加入25 μL 5×buffer，煮沸10 min，采用SDS-PAGE对蛋白的表达情况进行检测。1.3.6Western Blot鉴定诱导表达的VLTF-1经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素滤膜上，加入10 mL 5%的脱脂牛奶，4 ℃封闭过夜，TBST洗涤3次，每次5min。加入10 mL TBST1∶2 000稀释鼠源一抗含GST标签，室温摇床孵育1~2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。加入10 mL TBST1∶10 000稀释的HRP羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗，室温摇床孵育1 h，DAB染色观察。1.3.7生物信息学分析利用ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM Server v.2.0和SOPMA服务器对晚转录因子VLTF-1蛋白的生物信息进行系统的分析和研究。2结果与分析2.1晚转录因子VLTF-1基因PCR产物电泳（见图1）由图1可知，目的基因通过PCR扩增并用琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小约783 bp，与理论大小相符。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F001图１晚转录因子VLTF-1基因PCR产物电泳Fig.1Electrophoresis of PCR products of late transcription factor VLTF-1 gene注 ： M为DL2000 DNA Marker；1为VLTF-1基因PCR产物。2.2pET42b载体PCR产物电泳（见图2）由图2可知，目的基因片段与pET42b载体构建的表达载体用PCR检测，结果与预期相符。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F002图2pET42b载体PCR产物电泳Fig.2Electrophoresis of PCR products of pET42b vector注 ： M为DL2000 DNA Marker；1、2为阴性对照组；3为VLTF-1质粒。2.3酶切VLTF-1质粒产物（见图3）由图3可知，采用质粒小提试剂盒提取构建好的pET42b-GTPV-054质粒，NdeⅠ、XhoⅠ酶切鉴定构建成功。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F003图3酶切VLTF-1质粒产物Fig.3Enzyme digestion of VLTF-1 plasmid product注 ： M为DL2000 DNA Marker；1为重组质粒酶切。2.4序列分析利用DNAMAN、DNAStar将目的基因与设计的引物和Pellor基因进行同源性分析，同源性为100%。2.5晚转录因子VLTF-1遗传进化树分析（见图4）由图4可知，在NCBI上查找VLTF-1同源性接近的基因只有1个，利用DNAStar进行遗传进化树分析。结果显示，目的基因与山羊痘毒株属同一分支，其保守性较强，遗传关系亲近。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F004图4晚转录因子VLTF-1遗传进化树分析Fig.4Genetic evolution tree analysis of late transcription factor VLTF-12.6晚转录因子VLTF-1蛋白电泳及Western Blot检测（见图5、图6）由图5、图6可知，对重组的质粒转BL21表达蛋白并进行活化、诱导表达蛋白，进行SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定，得到大小为27 kDa的蛋白，Western Blot检测该蛋白特异性表达。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F005图5晚转录因子VLTF-1蛋白表达产物SDS-PAGE电泳Fig.5Sds-page electrophoresis of late transcription factor VLTF-1 protein expression products注 ： M为Marker；1为空载体对照；2为质粒。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F006图6晚转录因子VLTF-1蛋白Western Blot鉴定Fig.6Western Blot identification of late transcription factor VLTF-1 protein2.7晚转录因子VLTF-1蛋白亲疏水性分析（见图7）由图7可知，该蛋白含有260个氨基酸，分子式为：C1354H2133N353O388S15，分子量为30 ku，等电点为8.10，含有负电荷氨基酸29个，正电荷氨基酸31个，不稳定系数46.17（40），说明VLTF-1蛋白属于不稳定性蛋白。脂肪族系数98.92，平均亲水值-0.030，PoatScale服务器对晚转录因子VLTF-1蛋白的亲疏水性分析，标度值在大于0的区域比较密集，结合亲水值判断该蛋白为亲水性蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F007图7晚转录因子VLTF-1蛋白亲疏水性分析Fig.7Hydrophilicity analysis of late transcription factor VLTF-1 protein2.8晚转录因子VLTF-1蛋白信号肽、磷酸化位点及跨膜域结构域的预测分析(见图8、图9）由图8、图9可知，利用signalP 4.1 Server服务器分析显示，VLTF-1蛋白无信号肽；NetPhos 3.1 Server分析表明，当阈值为0.5时，晚转录因子VLTF-1蛋白有26个磷酸化位点，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点分别为18、5、3个；TMHMM Server v.2.0服务器分析表明，VLTF-1蛋白有1个跨膜结构域。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F008图8晚转录因子VLTF-1蛋白的磷酸化位点Fig.8Phosphorylation sites of late transcription factor VLTF-1 proteinXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F009图9晚转录因子VLTF-1蛋白的跨膜结构域Fig.9Transmembrane domain of late transcription factor VLTF-1 protein2.9晚转录因子VLTF-1蛋白的二级结构（见图10）由图10可知，VLTF-1蛋白的二级结构由27.31%的α-螺旋（h）、12.69%的β-转角（t）、23.08%的无规则卷曲（c）和36.92%的延伸链（e）组成。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.005.F010图10晚转录因子VLTF-1蛋白的二级结构Fig.10Secondary structure of late transcription factor VLTF-1 protein优势的抗原表位区域为：5~6、29~33、41~46、52~54、60~64、69~72、81~84、90~96、101~103、110~121、128~131、132~137、163~165、173~176、181~186、218~223、233~237、246~250、257~260。3讨论转录是在细胞核内进行的、以碱基互补配对为原则、以DNA一条链为模板合成mRNA的过程，是蛋白生物合成的第一步。真核生物含有DNA复制和基因转录的机器，许多病毒依赖于宿主实现复制和转录，故需要在细胞核中完成病毒转录。但在DNA病毒中，痘病毒科家族是例外，其复制和转录均在细胞质内进行，需要病毒编码因子参与成熟mRNA的产生过程，如RNA聚合酶因子Rpo147、Rpo132和转录因子VTF等。转录因子在转录过程中扮演关键的角色。痘病毒中，vRNAP能够根据DNA模版催化合成RNA，但需要其他辅助因子。病毒早期基因的转录需要早期转录因子（异二聚体VETF），晚期转录时也需要VLTF。本研究主要对山羊痘病毒的晚转录因子VLTF-1蛋白原核表达和蛋白的基本特性进行简单的研究，为进一步研究山羊痘病毒的机制和其他功能性蛋白提供参考。羊痘病毒含有4个晚转录因子，本研究对其中之一的VLTF-1基因进行PCR扩增，得到其大小为783 bp。通过同源性比较发现，SS株的VLTF-1基因与印度绵羊的亲缘关系最近为100%，推测此毒株可能由印度传播到中国新疆。遗传进化树分析表明，羊痘病毒属的3个种各分成一个分支，而SS株的VLTF-1基因与山羊痘病毒属同一分支。对VLTF-1进行原核表达，SDS-PAGE电泳和Western Blot验证得到大小为27 kDa的蛋白。但其以包涵体形式表达在沉淀中，与生物信息分析其为亲水性蛋白存在差异，原因可能与表达条件的选择有关，应进一步优化表达条件，获得可溶性表达的蛋白。痘病毒的转录含有5'帽子和poly-A尾巴，与宿主细胞产生mRNA类似。帽子结构包含一个N7-甲基化鸟苷残基，通过一个反向的5'-5'三磷酸连接加到新产生的转录产物的5'端，加帽过程发生在转录起始后不久[18]。对VLTF-1蛋白的氨基酸特性进行分析，发现其上有26个磷酸化位点，具有上述转录因子的特点。因此，该蛋白可能具有识别蛋白激酶的位点，干扰宿主机体信号传导。VLTF-1蛋白是一个膜蛋白，可能与其进出核膜或发挥其他生物学功能有关。痘病毒的转录在胞质中完成，但整个过程中不可能与胞核无关；且作为典型的转录因子，应含有DNA结合区、转录调控区、寡聚化位点以及核定位信号等功能区域。二级结构分析结果表明，VLTF-1蛋白为混合型蛋白，无规则卷曲和α-螺旋结构占主导位置，β-转角结构比较少。无规则卷曲和β-转角结构与抗体结合是形成抗原表位的关键，故VLTF-1蛋白可能含有许多B细胞抗原表位[19]。但不排除其他区域也存在抗原表位，是否存在还需要进一步研究加以确认。4结论本研究成功克隆晚转录因子VLTF-1基因，通过原核表达系统制备了VLTF-1蛋白，并利用生物信息学分析研究蛋白的结构和功能，为全面研究山羊痘病毒提供参考。