冷冻精液人工授精技术是动物繁殖领域一项重大创新，极大地提高了优良种公畜的利用率[1]。冷冻精液人工授精技术在传统家畜中已得到普遍应用，但在鹿的繁殖领域应用程度不高[2]。目前，辽宁省鹿的繁殖方式仍以自然交配为主，人工授精普及率低，母鹿受胎率不高，冷冻精液质量差。冷冻精液质量与鲜精品质、稀释液种类、稀释方法、冷冻等因素有关，其中精液冷冻技术是影响冷冻后精子活力主要因素。精子冷冻效果是指精子通过可对细胞产生致死性伤害的危险温区的速度。通过有效地控制降温速率，达到最佳冷冻温度，是决定精液冷冻效果的关键条件之一[3]。精子冷冻后的活力与降温速率密切相关。本试验从冷冻温度的选择入手，控制精液降温速率变化，进而找到适宜的精液降温速率，以达到提高精子复苏率的目的。试验结果对于提高优良种公鹿利用率、加快良种推广和种质资源保护具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料试验精液来自桓仁强风鹿业科研繁育基地，采集自3头梅花鹿。1.2主要仪器简易泡沫箱（规格70 mm×40 mm×40 mm，购自菜市场）、BX41型生物显微镜（Olympus）、ACCUREAD型精子密度仪（卡苏公司）、MCT-200型自动数字测温仪（北京宇时技术开发公司）细管0.25 mL、稀释液Bioxcell购自法国IMV卡苏公司；封口粉、托架购自沈阳富士平生物技术有限公司；250 µL移液器购自湖南力辰仪器科技有限公司。1.3试验设计试验分为A、B、C、D、E、F等6组，对应液氮面与冷冻面之间的距离分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 cm。每组同时冷冻3头鹿的精液，每头鹿3支细管含有精液，其他以稀释液代替。将测温仪探头插入一支含有精液的细管中固定，测定冷冻过程中精液温度的变化。另一台测温仪探头固定在托架上细管精液所在冷冻面位置，测定冷冻过程中冷冻温度的变化，测温仪自动记录间隔时间设置为10 s。根据精液在每组降温速率和精子复苏率，找出精液适宜冷冻温度范围，根据测温仪记录的数据绘制出精液降温变化曲线。1.4测定指标及方法泡沫箱倒入液氮后，调整液氮面与冷冻面间的距离，测定对应距离冷冻面的温度，即精液的初冻温度[4-5]。将已码放好细管精液的托架放入泡沫箱内，以液氮蒸气逐渐使其降温冻结约10~15 min，使细管精液遵循一定的降温曲线[6]。当细管内精液温度降至-130 ℃以下并维持一定时间后，即可直接投入液氮，测温仪按照预先设定的程序自动记录每一时刻的温度。1.4.1精液采集按照DB22/T 2599—2016梅花鹿精液采集及冷冻技术规程进行[7]。1.4.2精液生产判定精子活力、测定精液密度、测量采精量；根据活力、密度、采精量和每支细管精液应含有的有效精子数量，采用稀释液对精液进行一次性稀释；精液稀释后室温静置10 min，采用移液器分装至细管，以封口粉封口；分装后的细管精液放入4~5 ℃低温柜中降温平衡3~4 h；细管精液于4~5 ℃码帘上架，待冷冻。1.4.3冻精活力评定精液解冻后，于载有37 ℃恒温板的显微镜下检查活力，精子活力评定按照梅花鹿冷冻精液DB22/T 2611—2017进行[8]。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel进行初步处理，Graph Pad Prism 5软件进行统计学分析，两组间差异采用独立样本t测验比较，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1初冻温度对精液降温速率的影响（见表1）由表1可知，精液降温速率由高到低为A组B组C组D组E组F组。其中A组降温速率最高，为57.6 ℃/min，显著高于其他各组（P0.05）；B、C组显著高于D、E、F组（P0.05），但组间差异不显著（P0.05）。结果表明，初冻温度与精液降温速率密切相关。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.004.T001表1初冻温度对精液降温速率的影响Tab.1Effect of initial freezing temperature on the rate of semen cooling组别距离/cm初冻温度/℃热平衡温度/℃降温速率/(℃/min)入氮温度/℃冷冻时间/sA组2.0-180.5±0.3-102.9±2.157.6±0.3a-130.8308B组2.5-169.7±1.4-91.5±2.838.2±0.8b-129.3575C组3.0-160.3±3.1-80.2±3.436.7±1.1b-132.5667D组3.5-151.9±6.2-76.3±2.130.1±1.5c-133.2741E组4.0-125.6±5.5-62.7±1.827.3±2.1c-128.9882F组4.5-118.4±2.3-56.8±0.725.6±1.8c-134.1932注 ：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2精液冷冻过程中降温曲线的变化（见图1）由图1可知，当精液和冷冻面接触后温度迅速下降，冷冻面温度随之急剧上升；当精液下降温度和冷冻面上升温度达到一致时，即热平衡温度；随后精液温度随着冷冻温度的变化而急剧下降，当精液温度达到-130 ℃以下时进入玻璃化状态[9]。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.004.F001图1精液冷冻过程中降温曲线的变化Fig.1Change of cooling curve during semen freezing结果表明，初冻温度影响精液温度下降速率和温度回升的幅度，可得出鹿细管冷冻精液初冻温度变化规律。精液降温速率和冷冻温度回升的幅度受初冻温度的影响，初冻温度越低，精液降温速率越快，温度回升幅度越低；初冻温度越高，精液降温速度越慢，温度回升幅度越高。精液冷冻从开始5 ℃至冷冻结束-130 ℃所经历的过程，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3个温区，不同温区精液降温速率不同。2.3初冻温度对精子复苏率的影响（见表2）由表2可知，初冻温度由高到低为A组B组C组D组E组F组，冷冻后精子活力由高到低为C组B组D组E组A组F组。其中C组冻精活力最高，为0.54；精子复苏率最高，达69.2%。C组冻精活力、精子复苏率均显著高于A、D、E、F组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.004.T002表2初冻温度对精子复苏率的影响Tab.2Effect of initial freezing temperature on sperm resuscitation rate组别初冻温度/℃原精活力冻精活力精子复苏率/%A组-180.5±0.30.78±0.050.35±0.03b44.80±5.41bB组-169.7±1.40.78±0.050.52±0.05a66.70±6.27aC组-160.3±3.10.78±0.050.54±0.06a69.20±7.58aD组-151.9±6.20.78±0.050.38±0.04b48.70±5.61bE组-125.6±5.50.78±0.050.36±0.03b46.20±6.30bF组-118.4±2.30.78±0.050.33±0.04b42.30±5.28b注 ：精子复苏率为精子冷冻后活力与冷冻前活力的百分比。结果表明，精液冷冻后精子活力的差异由冷冻时不同的温度变化所决定，冷冻温度过低或过高，精液降温速率过快或过慢，精子活力均会受到影响。精液只有在适宜的温度范围内冷冻才能获得理想的冷冻效果。本研究中，C组和B组精液降温速率分别为36.7和38.2 ℃/min，精子复苏率分别为69.2%和66.7%，与前期研究报道的35 ℃/min的降温速率趋于一致[10]。3讨论使用简易泡沫箱，采用静止的液氮蒸气熏蒸法进行冷冻，在液氮面和箱口平面间会自然地形成温度梯度。距离液氮面越近，温度越低，与冻前细管的温差也越大，此方法是依靠调节冷冻面距液氮面的高低控制初冻温度和降温速率。本试验中，不同的距离条件下，精液的初冻温度、热平衡温度、降温速率和精液入氮所经过的时间不同。液氮面与冷冻面间的距离越近，初冻温度越低，精液降温速率越快，冷冻过程时间越短；液氮面与冷冻面间的距离越远，初冻温度越高，精液降温速度越慢，冷冻过程时间越长。在其他相同的条件下，由于冷冻面与液氮面之间高度不同，会影响初冻温度、回升温度、降温速率和冷冻时间。本试验中，液氮面与冷冻面之间的距离为3.0 cm时，在开始冷冻后96 s达到-85 ℃的热平衡温度，经500 s达到-130 ℃以下，解冻后精子活力0.54。侯放亮[11]报道，精液在-80~-110 ℃适宜范围内，达到热平衡温度及安全温度的时间短，精液冷冻后精子复苏率得到提高，与本试验结论一致。在精液冷冻过程中，冷冻温度和降温速率是影响精子冷冻后活力的主要因素。距离液氮面越近，温度越低，与冻前细管精液的温差越大，精液降温速率快，而精液降温速率是影响精子复苏率的主要因素。本试验中，鹿精液冷冻初冻的适宜温度为-160.3~-169.7 ℃，9~11 min内达到并维持此温度区域后再继续降温直至存入液氮，与金穗华[12]报道的冷冻的温度控制在-140 ℃左右，冷冻过程控制在8 min内的结论不一致，可能与冷冻容器大小、一次冷冻细管精液的数量不同有关。精液降温变化曲线的斜率取决于冷冻速率，而冷冻速率主要取决于精子与稀释液之间的温差。温差大时，降温速率较快，曲线斜率越显著。有研究表明，精液在不同温区的降温速率不同[13]。精液在5~-100 ℃温区时，细管和冷冻面接触后，精液温度迅速下降，随着降温梯度由液态变为结晶态；此后精液温度缓慢下降。当精液温度达到-130 ℃时，精液由结晶态转变为玻璃态。精液冷冻过程中的降温是技术的难点。冷冻过程中，精细胞内、外形成冰晶的大小主要取决于降温速率，若温差不大，降温速率较慢，则缓慢地形成大冰晶。精细胞内大冰晶的形成可对精子产生不可逆的机械损伤，导致精子死亡。快速降温的速率存在一定限度，为避免由于冰晶形成和电解质浓度变化而严重损伤精子，适宜的降温速率非常重要。精液冷冻过程中，若能避开细胞慢速降温时脱水和快速降温时的冰晶的损害，温度安全达到-130 ℃，冷冻即可获得成功[14]。细胞对温度的反应敏感，除添加防冻害的保护剂外，还可采取控制降温速率以减少或消除冻害。-60~0 ℃是冰晶形成的温度区域，尤其-15~-25 ℃危险区域。冰晶是在逐渐降温的条件下形成的，降温越慢，形成的冰晶越大。因此，玻璃化必须在-250~-60 ℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而进入玻璃化阶段[15]。4结论采用简易装置冷冻细管精液，精液经降温平衡后采用液氮蒸气熏蒸冷冻，通过调整液氮面与冷冻面之间距离控制精液初冻温度，若使用得当同样能够获得较为理想的冷冻效果。选择合适的精液冷冻温度和降温速率极其重要，应根据每次冷冻细管精液数量适当调整液氮面与冷冻面之间的距离。